[发明专利]用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体系统

说明书

本发明公开了一种用于检测松材线虫的gRNA，包含a)向导序列例如SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。本发明还公开了一种用于检测松材线虫的试剂盒，包含所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA。本发明还公开了载体系统，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码所述gRNA的核苷酸片段。

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测松材线虫的gRNA、试剂盒及载体系统。

背景技术

松材线虫病，即松树萎蔫病是当今世界四大林木病害之一，被称为松树的“癌症”，而引起该病害的病原为松材线虫，在我国属于二级检疫对象。由于松材线虫肉眼不可直接观察，需要依靠专业的设备和人员，区分和鉴定松材线虫对检疫人员来说不仅任务繁重，而且是一个很大的挑战。对松材线虫进行有效识别，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的作用。目前，进出境口岸对松材线虫种类鉴定的主要手段是形态学观察、生化检测和分子生物学检测三大类，但是这些检测手段远远不能满足口岸部门对于松材线虫病高效、精准的检出要求。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。尽管现有技术中已有一些利用分子生物学手段对松材线虫进行特异性检测和鉴定，如：特异性引物PCR法、ITS-PCR-RFLP法和实时荧光定量PCR法等，这些方法具有快速、高效、低污染等优点，但是特异性引物PCR法和ITS-PCR-RFLP法需要电泳、染色、成像等多个步骤，而实时荧光定量PCR法所使用的仪器设备投入大，标记探针、试剂成本高，普适性较差，在检疫性鉴定应用方面存在缺陷，不能满足口岸和林间日常检测筛查的需要。

近年来，随着CRISPR基因编辑技术兴起，科学家基于RPA技术开发了以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术（SHERLOCK技术），还开发了以Cas12酶为核心的诊断技术。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

基于此，有必要针对松材线虫的检测问题，提供一种用于检测松材线虫的crRNA、试剂盒及载体系统。

本发明的目的之一在于提供一种用于检测松材线虫的gRNA，包含a)向导序列为SEQ ID NO:1，其能够杂交至靶核苷酸序列，和b)与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测松材线虫的试剂盒，包含所述的gRNA或可转录为所述gRNA的DNA。

本发明的目的之三在于提供一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述载体包含：第一调控元件和第二调控元件，所述第一调控元件可操作地连接至编码Cas核酸酶的核苷酸片段，所述第二调控元件可操作地连接至编码所述gRNA的核苷酸片段。

本发明利用CRISPR/Cas技术实现松材线虫核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25℃～37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到2.8´10³ copies/μL，说明本发明方法敏感性较好。

附图说明

图1为本发明一实施例的敏感性检测结果图，其中，N表示阴性对照，Bx表示Bursaphelenchusxylophilus (松材线虫)，Bm表示Bursaphelenchusmucronatus (拟松材线虫)；