[发明专利]文库构建引物组及其在高通量检测中的应用

说明书

本发明涉及一种快速准确的文库构建引物组及其在高通量检测中的应用，属于基因检测技术领域。该文库构建引物组包括若干用于目标区域扩增的扩增引物和用于文库构建的测序接头，扩增引物依次包括与目标区域序列匹配的靶向序列段、起到唯一识别作用的单分子标签段和与测序接头匹配的建库段，若干单分子标签段中包含长度不等的随机碱基。采用该引物组可以用于快速、准确构建碱基平衡的文库，缩短建库时间，降低污染和测序成本，更精准的对数据进行纠错，提高技术的准确性。可以更便捷高效的用于科研、临床研究中。在科研项目中，不需要产能太高的测序仪就可以对免疫组进行测序，并且不需要碱基平衡文库，方便高效，促进和扩大免疫组的应用和发展。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种快速准确的文库构建引物组及其在高通量检测中的应用。

背景技术

免疫组库(Immune Repertoire，IR)被定义为在任何特定时间下，机体适应性免疫系统的T淋巴细胞表面受体(T cell receptor，TCR)和B淋巴细胞表面受体(B cellreceptor，BCR)的总和。在T/B细胞成熟过程中，会发生VDJ基因的重排，在重排过程中随机选取一种V、D和J基因串联在一起，组成TCR/BCR的可变区，同时还会在接合部位发生碱基的随机的插入和删除，因此几乎每个新产生的T/B细胞的TCR/BCR基因都各不相同，组成数量庞大的TCR/BCR免疫组库，赋予机体识别各种不同抗原的能力。通过高通量测序对TCR/BCR的编码基因进行分析，可以对免疫组库进行解码，用于对免疫系统的多样性和特异性进行分析。

免疫组库的应用越来越广泛，可应用于自身免疫性疾病、肿瘤早筛、健康监测、疫苗评价等，因此，进行免疫组库检测的需求也越来越大。

目前最常用的免疫组库检测方法为二步法PCR，经过两次PCR得到可以上机测序的产物，容易引入无法拆分的污染，建库时间至少1天；也有采用一步法PCR进行检测的，但是通常为应用于突变检测，所用引物较少，也没有引入纠错机制。且由于免疫组序列相似性高，容易造成碱基不平衡，需要与碱基平衡的文库一起上机测序，碱基平衡文库需要占20％-30％的比例。

具体而言，二步法PCR无法一开始加入barcode区分不同的样本，因此数据无法拆分污染的序列，污染比例高，并且建库时间较长(至少1天)、成本较高。现有的一步法PCR又无法准确的进行PCR和测序纠错。无论一步法还是二步法PCR，都无法解决免疫组V区序列相似性高，容易造成碱基不平衡的问题，即测序时同个位置的碱基比例较单一时，会影响碱基读取，导致无法读取碱基信号，所以经常需要在测序同个lane另外与20％-30％碱基平衡的文库(如全基因组、外显子等文库)一起上机，造成测序成本的提高。

综上所述，开发一套成本低、准确性高的免疫组构建方法势在必行。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种文库构建引物组，采用该引物组进行高通量测序，可降低污染比例，减少建库成本，缩短建库时间，更精准的对数据进行纠错，提高序列的准确性，且应用于免疫组库检测时，能够解决免疫组碱基不平衡的问题。

一种文库构建引物组，包括若干用于目标区域扩增的扩增引物和用于文库构建的测序接头，所述扩增引物依次包括与目标区域序列匹配的靶向序列段、起到唯一识别作用的单分子标签段和与测序接头匹配的建库段，若干所述单分子标签段中包含长度不等的随机碱基。

上述文库构建引物组，通过在目标区域扩增的特异性扩增引物中插入起到唯一识别作用的单分子标签(UMI)，一方面可通过其中包括的随机碱基的不同长度使同一种引物扩增的相似性高的序列，以引物碱基个数不同而错开，解决了某些区域碱基不平衡的问题；另一方面，由于可在后续数据分析过程中更精准的对数据进行纠错，从而可采用一步法建库，缩短了建库时间，建库时间约3小时，同时降低污染和测序成本，更精准的对数据进行纠错，提高检测技术的准确性。

在其中一个实施例中，所述扩增引物与所述测序接头序列的摩尔比为1:3-5。采用上述配比，具有较好的建库效果。