[发明专利]一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法

权利要求书

1.一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；

(2)分选富集TILs中PD1阳性T细胞；

(3)一次性将PBR转化融合蛋白和IL-15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中；所述PBR转化融合蛋白包括：PD1的胞外区、41BB的胞内区和△IL2RB(YRHQ)的截段，并按顺序连接；所述IL-15超级复合物包括：信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素-15突变体IL-15-M-N72D、Linker2、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域、CD-4跨膜区，并按顺序连接；

所述PD1的胞外区、41BB的胞内区和△IL2RB(YRHQ)的截段的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；所述信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素-15突变体IL-15-M-N72D、Linker2、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域和CD-4跨膜区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示；

(4)通过扩增培养，获得肿瘤增强型TILs。

2.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，经病理组织学确认的肿瘤组织，经组织块破碎法处理后，浸润于培养液中，后从组织中游离出来所述TILs；所述肿瘤组织选自前列腺癌组织、肺癌组织或胃癌组织。

3.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，通过抗体磁珠分选富集TILs中PD1阳性T细胞。

4.根据权利要求3所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述通过抗体磁珠分选富集，是指按顺序使用下列试剂分选出PD1阳性的TILs细胞：

CD279(PD1)抗体、抗APC MicroBeads、支持试剂盒、CD20 Cytoplasmic抗体、抗PE MicroBeads UltraPure和支持试剂盒。

5.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，利用PB转座子系统以电转的方式一次性将PBR转化融合蛋白和IL-15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中。

6.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，编码所述PD1、41BB和△IL2RB(YRHQ)的DNA序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

7.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，编码所述信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素-15突变体IL-15-M-N72D、Linker2、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域和CD-4跨膜区的DNA序列分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20所示。

8.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述一次性将PBR转化融合蛋白和IL-15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中前，先将所述IL-15超级复合物与PBR连接，两者连接所用的2A连接肽为P2A或F2A；所述P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码所述P2A的DNA序列如SEQ ID NO:22所示。

9.根据权利要求1所述的肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述扩增培养使用的培养基为无血清的悬浮细胞培养基。

10.一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞，由权利要求1-9任一项所述制备方法制得。