[发明专利]一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)从肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；(2)分选富集TILs中PD1阳性T细胞；(3)一次性将PBR转化融合蛋白和IL‑15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中；(4)通过扩增培养，获得肿瘤增强型TILs。本发明①通过分选PD1阳性的T细胞提升肿瘤特异性T细胞的比例；②设计的PBR融合蛋白能够解除肿瘤微环境中来自PD1通路的抑制，提高TILs对肿瘤细胞的杀伤能力；③IL‑15超级复合物不仅可以提高T细胞的肿瘤杀伤活力，还可以刺激体内的内源性NK、T细胞等其他免疫细胞，加速对体内肿瘤细胞的清除；④加装的“自杀基因”R结构解决了T细胞基因改造后，后续临床的安全性。

技术领域

本发明涉及一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，属于肿瘤浸润淋巴细胞制备技术领域。

背景技术

肿瘤目前是对人类威胁最大的疾病之一，早期发现通过手术、化疗等常规治疗多数只能延缓病情，发展到晚期则缺乏较好的治疗手段。近年来免疫治疗技术发展迅速，不论CAR-T还是PD1/PD-L1免疫卡控点抗体药物陆续上市，为肿瘤治疗带来希望。针对肿瘤的免疫细胞研究如火如荼，并取得一些进展，包括目前全球上市的DC疫苗、CAR-T，然而目前大部分免疫细胞技术都是针对肿瘤单靶点或少数几个靶点，面对异质性较强的肿瘤疗效有限。

TILs作为常规过继免疫细胞疗法已经有40多年的临床应用，相较于外周血培养的LAK、CIK等免疫细胞而言，TILs中因相对较多的肿瘤特异性杀伤T细胞，因此在包括黑色素、卵巢癌、乳腺癌等众多肿瘤中均取得一定的治疗效果，而越来越多的临床试验加速TILs作为一种特殊的免疫细胞治疗技术或药物上市，为众多肿瘤的治疗提供一种选择。

然而临床试验也发现TILs的众多不足之处：①首当其冲是异质性较强，虽然TILs含有的肿瘤特异性杀伤T细胞，但是大部分免疫细胞不具备肿瘤杀伤功能，而且不同患者TILs含有的肿瘤特异性杀伤T细胞数量不一，而制备中是无选择性的扩增，最终导致不同患者制备的TILs质量不一，因此也导致后续临床效果大不相同；②传统技术制备的TILs面临来自肿瘤微环境中PD1信号通路的抑制，因此无法最大程度发生肿瘤杀伤作用；③传统技术制备的TILs活力差，体内存活时间短，综上述原因导致传统的TILs临床疗效不一，需要通过技术升级突破治疗瓶颈。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种肿瘤增强型肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)从肿瘤组织中提取肿瘤淋巴细胞TILs；

(2)分选富集TILs中PD1阳性T细胞；

(3)一次性将PBR转化融合蛋白和IL-15超级复合物整合到PD1阳性T细胞中；所述PBR转化融合蛋白包括：PD1的胞外区、41BB的胞内区和△IL2RB(YRHQ)的截段，并按顺序连接；所述IL-15超级复合物包括：信号肽、“自杀基因”R结构、Linker1、白细胞介素-15突变体IL-15-M-N72D、Linker2、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域、CD-4跨膜区，并按顺序连接；

(4)通过扩增培养，获得肿瘤增强型TILs。

优选的，步骤(1)中，经病理组织学确认的肿瘤组织，经组织块破碎法处理后，浸润于培养液中，后从组织中游离出来所述TILs；所述肿瘤组织选自前列腺癌组织、肺癌组织或胃癌组织等。

优选的，步骤(2)中，通过抗体磁珠分选富集TILs中PD1阳性T细胞。

进一步优选的，所述通过抗体磁珠分选富集，是指按顺序使用下列试剂先分选出PD1阳性的TILs细胞：