[发明专利]激活Wnt/β-catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用

说明书

本发明涉及水牛体外胚胎生产技术领域，特别涉及激活Wnt/β‑catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用，本发明针对水牛的Wnt/β‑catenin信号通路进行研究，最终发现，Wnt通路的抑制剂会降低水牛卵母细胞的成熟率，而Wnt通路的激活剂能提高水牛卵母细胞的成熟率。为此，申请人通过在水牛卵母细胞成熟液中添加Wnt通路激活剂氯化锂(LiCl)来实现提高水牛卵母细胞的成熟率、水牛胚胎分裂率和水牛胚胎囊胚率的目的，从而对水牛体外胚胎生产效率起到了良好的促进作用。

【技术领域】

本发明涉及水牛体外胚胎生产技术领域，特别涉及激活Wnt/β-catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用。

【背景技术】

繁殖效率低下是目前水牛产业化发展的瓶颈，而利用体外胚胎生产这类繁殖新技术可以一定程度上提高水牛良种胚胎供应能力，本领域技术人员的长期研究发现，不同物种之间的体外胚胎发育能力不同，同为牛属，但水牛卵母细胞的体外发育潜能仍远低于黄牛。经研究，水牛卵母细胞的体外成熟率约为50-65％，而黄牛卵母细胞的体外成熟率约为80-90％；水牛卵母细胞的体外囊胚率约为18-25％，而黄牛卵母细胞的体外囊胚率约为30-45％。正是由于水牛的体外胚胎生产效率低，限制了水牛体外繁殖在水牛产业化的推广应用。

申请人一直致力于提高水牛胚胎的体外发育能力，现有技术中报道Wnt/β-catenin信号家族成员是卵巢功能调控的重要因素，Wnt通路影响雌激素的生成并调控卵泡刺激素(FSH)的作用，然而对小鼠的研究却表明其卵母细胞的成熟并不依赖Wnt通路，在鼠体内过表达β-catenin还会阻断卵母细胞的减数分裂成熟；而在某些猪物种中，研究发现WNT/β-catenin特异性抑制剂FH535可以促进猪卵母细胞的成熟；而在申请人的后期研究中发现，在水牛物种中并不存在上述效果。因此，由于Wnt通路连锁基因的相对复杂，WNT/β-catenin通路在不同物种之间的差异巨大。为此，有必要针对Wnt通路对水牛卵母细胞发育潜能的影响进行研究，找出一种适合水牛物种体外胚胎发育的方法，提高水牛的体外繁殖率。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要针对Wnt通路对水牛卵母细胞发育潜能的影响进行研究，找出一种适合水牛物种体外胚胎发育的方法，提高水牛的体外繁殖效率。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

激活Wnt/β-catenin信号通路在提高水牛体外胚胎生产效率中的应用，在体外环境下，通过添加Wnt/β-catenin信号通路的激活剂来激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进水牛卵母细胞的成熟和之后的胚胎发育效率。

进一步的，所述激活Wnt/β-catenin信号通路的激活剂为氯化锂。

本发明还包括一种提高水牛外胚胎的生产效率的方法，所述方法为：

(1)获取水牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes，COCs)；

(2)将步骤(1)获取的复合体放入成熟培养液中进行体外成熟培养；所述成熟培养液中应用了所述激活Wnt/β-catenin信号通路的激活剂；

(3)成熟培养24h后取水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)转入覆盖石蜡油的IVM液微滴内，培养22-24h；

(4)将步骤(3)成熟的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)转入体外受精(IVF)液微滴中，与水牛精子共同孵育22-24h，完成体外受精；

(5)将步骤(4)受精后的水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)用胚胎培养液清洗3次后，用卵丘细胞单层液替代胚胎培养液对清洗后的受精卵进行胚胎培养，即得水牛的体外胚胎。