[发明专利]一种仿刺参精酶解工艺优化及酶解液抗氧化活性研究方法

权利要求书

1.一种用响应面法优化仿刺参精酶解的加工工艺，其特征在于，响应面法优化仿刺参精酶解加工工艺的最佳水解条件为温度70 ℃，加酶量4.4%，水解时间4 h；

响应面法优化仿刺参精酶解具体加工工艺的操作步骤为：

步骤一，仿刺参精酶解：仿刺参精清洗干净，沥干水分后经由胶体磨研磨匀浆，准确称取仿刺参精匀浆液10 g，加入0.5-0.7 g木瓜蛋白酶，混合均匀，在恒温水浴锅中进行酶解，酶解完成后立即取出，将酶解液置于100 ℃水浴锅中灭酶10 min；

步骤二，水解度的测定：根据三氯乙酸TCA方法测定水解度，取1 mL酶解液加入1 mL的10 g/100 mL的TCA，混合振荡，静止10 min后，10000 r/min离心10 min，取上清液以双缩脲法测可溶性蛋白含量，用凯氏定氮法测总蛋白含量，按照下式计算水解度DH：

 DH = (ρ₁-ρ₂₎/(ρ₀-ρ₂)×100                                     （1）

步骤三，单因素研究：为了考察酶解温度、加酶量和酶解时间三个因素对水解度的影响，首先进行单因素实验，制定酶解的基本条件为：酶解温度65 ℃，加酶量[E/S]3%，时间5h；固定其中两个条件，改变另外一个条件，分别考察不同的影响因素；

步骤四，响应面法优化水解条件：在单因素实验的基础上，以水解度为衡量指标，选取酶解温度、加酶量和时间三个因素，设计了三因素三水平的响应面实验，选用木瓜蛋白酶，进行酶解条件的优化，根据单因素实验结果，采用Box-Behnken设计实验，分析三个因素对水解度的影响，试验次数为17次，其中析因部分试验次数12次，中心点重复试验次数5次。

2.根据权利要求1所述一种用响应面法优化仿刺参精酶解的加工工艺，其特征在于，所述计算水解度DH式中：ρ₁为反应后酶解液中可溶性蛋白含量mg/mL；ρ₂为反应前仿刺参精中可溶性蛋白含量mg/mL；ρ₀为仿刺参精中总蛋白含量mg/mL。

3.根据权利要求1所述一种用响应面法优化仿刺参精酶解的加工工艺，其特征在于，所述单因素研究中各因素取值范围如下：酶解温度分别为50、60、65、70、80 ℃，加酶量分别为1%、2%、3%、4%、5%，时间分别为3、4、5、6、7 h。

4.根据权利要求1所述的一种用响应面法优化仿刺参精酶解的加工工艺，其特征在于，所述加工工艺还包括采用Pall Minimate超滤系统从酶解液中分离得到三种不同分子量范围的多肽的制备方法。

5.根据权利要求4所述的一种用响应面法优化仿刺参精酶解的加工工艺，其特征在于，所述多肽的具体制备方法为：

步骤一，梯级肽的制备：将仿刺参精酶解液加蒸馏水稀释两倍，10000 r/min离心10min，取上清液，先用普通滤纸过滤，再依次用0.45 μm和0.22 μm的微孔滤膜过滤；然后采用Pall Minimate超滤系统，将过滤后的仿刺参精酶解液加入到超滤杯中，安装切向流膜包，控制压力在20-30 psig下进行超滤，分别收集滤出液和截留液；

步骤二，选择截留分子量为10 KDa的膜包进行超滤，超滤开始后，当超滤杯中酶解液剩余1/5时，收集滤过液，并将超滤杯中补充蒸馏水至初始体积，再次超滤，重复三次后停止超滤，收集每次滤过液,分子量﹤10 KDa的多肽和截留液,分子量﹥10 KDa的蛋白质；再分别选用截留分子量为5 KDa和1 KDa的切向流膜包，最终制备出三种不同分子量范围的多肽，将收集到的三种多肽溶液进行真空冷冻干燥处理。