[发明专利]基于单一标准FRET质粒测量FRET系统矫正参数的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于单一标准FRET质粒测量FRET系统矫正参数的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)圈选细胞区域获取三通道平均荧光强度数据

将已知效率值E₁与供体受体浓度比R₁的标准FRET质粒转染到细胞中，待转染的质粒表达成功后，先选定n个细胞分别进行三通道荧光成像，获得三通道平均荧光强度I_DD、I_AA、I_DA图像，然后在I_DD、I_AA、I_DA图像中的细胞里圈选m个不同细胞区域，分别获得三通道平均荧光强度I_DD1、I_AA1、I_DA1，I_DD2、I_AA2、I_DA2......I_DDm、I_AAm、I_DAm，并以第1个细胞区域获得的三通道平均荧光强度I_DD1、I_AA1、I_DA1为第一小组数据，以第2个细胞区域获得的三通道平均荧光强度I_DD2、I_AA2、I_DA2为第二小组数据，依次类推，以第m个细胞区域获得的三通道平均荧光强度I_DDm、I_AAm、I_DAm为第m小组数据，再以2个细胞区域的数据为一组，将数据两两分为t组；其中，n为正整数且n≥1，m≥2，t≥1；

(2)计算FRET系统矫正参数β，λ，G因子和k因子

①根据步骤(1)中得到的t组数据中的第一组数据和如下方程计算FRET系统矫正参数β₁，λ₁，G₁和k₁：

min f(β₁，λ₁，G₁，k₁)＝|y₁|+|y₂|+|y₃|+|y₄|

s.t.

β₁＞0；λ₁＞0；G₁＞0；k₁＞0；

λ′+e＞λ₁＞λ′-e；

β′+e₁＞β₁＞β′-e₁；

0＜e₁＜1；0＜e＜1；

e为大于零的常数，e₁为大于零的常数；

其中：

λ′为供体发射光谱和受体发射滤光片光谱通带交点处最高效率值e_Dα与供体发射光谱和供体发射滤光片光谱通带交点处最高效率值e_Dd的比值λ′＝e_Da/e_Dd；

β′为受体激发光谱和供体激发滤光片光谱通带交点处最高效率值e_dA与受体激发光谱和受体激发滤光片光谱通带交点处最高效率值e_aA的比值乘以供体激发和受体激发的照明相对强度比φ的结果值β′＝(e_dA/e_aA)*φ；

②将步骤①中的第一组数据替换为第二组数据，按上述方程计算得到FRET系统矫正参数β₂，λ₂，G₂和k₂；依次类推，直到计算得到第t组数据的FRET系统矫正参数β_t，λ_t，G_t和k_t；最后分别求β₁、β₂......β_t，λ₁、λ₂......λ_t，G₁、G₂......G_t和k₁、k₂......k_t的平均值β_v，λ_v，G_v，k_v；该β_v，λ_v，G_v，k_v即为FRET系统矫正参数β，λ，G因子和k因子。