[发明专利]基于单一标准FRET质粒测量FRET系统矫正参数的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于单一标准FRET质粒测量FRET系统矫正参数的方法及其应用。本发明方法仅需对转染了一种标准FRET质粒的细胞进行三通道荧光成像，通过物理分析与数学计算方程，即可计算得到FRET系统矫正参数β，λ，G因子和k因子，将原本至少需使用四种实验样本减少到一种，极大减少了必须使用的生物样本数量，提高了实验效率，具有很高的便捷性、稳定性和可靠性。

技术领域

本发明属于荧光共振能量转移(FRET)检测技术领域，特别涉及一种基于单一标准FRET质粒测量FRET系统矫正参数的方法及其应用。

背景技术

定量FRET显微术已经成为在活细胞中研究生化分子动态过程的重要工具。定量FRET检测技术不仅可以用于活细胞中分子结合与分离的实时动态研究，而且还可以用于活细胞中生物单分子结构信息比的测量。

基于三个滤光片组合的FRET显微成像术(简称3-cube FRET microscopy，E-FRET方法)。要求分别利用三个不同的荧光滤光片组对FRET样本得到三种图像：供体通道图像(I_DD，通过供体激发光激发时在供体荧光探测通道探测到的供体荧光)，受体通道图像(I_AA，通过受体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的受体荧光)，FRET通道图像(I_DA，通过供体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的荧光)。

系统矫正参数(a、b、c、d、G因子和k因子)是定量FRET检测的关键参量。a、b、c、d表示供体和受体光谱之间的荧光串扰光谱系数；G因子表示的是敏化受体发射的荧光(F_c)占由于发生FRET使供体发生淬灭的荧光的比值；k因子表示的是在没有发生FRET的情况下相同摩尔浓度的供受体荧光强度的比值。对于一种给定的FRET荧光团对和成像系统，系统矫正参数是恒量。测量获得可靠的系统矫正参数a、b、c、d、G因子和k因子是定量FRET测量的关键。

目前的方法主要是通过分别单独转染供体和受体的细胞测量四个光谱串扰系数a、b、c、d，利用标准FRET质粒测量G因子和k因子。科研人员已开发多种测量G因子方法。Zal和Gascoigne[T.Zal and N.R.J.Gascoigne,“Photobleaching-corrected FRETefficiency imaging of live cells,”Biophys.J.86(6),3923–3939(2004)]提出一种基于逐渐漂白固定FRET细胞样本的受体来确定G因子的方法，该方法需要同时测量漂白前后FRET样本三个通道的图像，至少需要转换滤光片组(cube)4次。Nagy等人[Nagy,Peter,etal.“Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonanceenergy transfer measurements between visible fluorescent proteins,”CytometryPart A67(2),86-96(2005)]通过三种供受体浓度比为1:1且E值不同的FRET串联结构来确定G值，这种方法需要的活细胞样本多，实验过程繁琐，数据处理较为困难。Chen等人[H.Chen et al.,“Measurements of FRET Efficiency and Ratio of Donor toAcceptor Concentration in living Cells,”Biophys.J.91(5),L39-L41(2006)]提出在活细胞中用两个供受体浓度比为1:1且E值未知的FRET串联结构来确定G因子，这种方法需要准备两种效率不同的FRET活细胞样本，并且两种FRET样本必须在完全相同的条件下测量。本课题小组[J.Zhang et al.,“Reliable measurement of the FRET sensitized-quenching transition factor for FRET quantification in living cells,”Micron88,7-15(2016).]曾提出将两种转染不同质粒的细胞放在同一个细胞培养皿中进行G值测量的方法，保证表达两种FRET质粒的细胞的测量在相同条件下，实现对一皿细胞进行数据采集并计算G值，在一定程度上提高了实验效率。尽管到目前为止科研人员为获取准确的系统矫正参数对测量方法做了一些改进，但实际测量过程仍然要求单独转染供体和单独转染受体的细胞并转染两种以上的质粒，并且至少需使用四种实验样本，实验过程复杂并且效率有待提高。这对在活细胞中实施FRET测量十分不利，阻碍了FRET技术被更为广泛的应用。