[发明专利]一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，其特征在于，包括RB-N1F和RB-N1R2；

所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂；

所述荧光PCR扩增用试剂包括2×SYBRGreenqPCRMix；

所述普通PCR扩增用试剂包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。

5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种：解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。

6.权利要求1所述引物对或权利要求2～5任意一项所述试剂盒在检测柑橘植株感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。

7.一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检测样品的RNA；

2)将步骤1)中RNA进行反转录，得到cDNA；

3)以步骤2)中所述cDNA为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4)将步骤3)中所述PCR扩增产物进行片段分析，得到待测样品是否感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的结果。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增包括普通PCR扩增和荧光PCR扩增；

所述普通PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；

所述荧光PCR扩增的反应程序为：95℃预变性20s；95℃5s，55℃15s，72℃20s，40个循环。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，根据PCR扩增的方法进行片段分析：当采用普通PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若得到的条带为524bp，表示待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，当采用荧光PCR扩增时，所得PCR扩增产物进行实时荧光定量检测，所得溶解曲线在退火温度为55℃时为单一峰，说明待测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒，反之则没有感染或待检测样品感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒的浓度没有达到检测限。