[发明专利]一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供了一种基于RT‑PCR技术检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法，属于植物病理学技术领域。本发明针对前期研究中分离的RB‑N1基因型柑橘衰退病毒设计一对特异性强的引物对，并建立了一种基于RT‑PCR技术检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒的检测试剂盒。采用所述试剂盒检测RB‑N1基因型柑橘衰退病毒，具有操作简单快速、高效、检测结果重复性好、检测灵敏度高的特点，为更好的研究CTV分离株的RB‑N1基因型在全国的发生情况提供了一个强有力的技术支撑。

技术领域

本发明属于植物病理学技术领域，具体涉及一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法。

背景技术

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病是一种极具经济重要性的病害，各柑橘产区均有发生，该病主要通过接穗和蚜虫进行扩散和传播，严重影响着柑橘的产量和品质，对全世界柑橘产业造成了严重的威胁。CTV属于长线形病毒属(Closterovirus)，病毒粒子呈11×2,000nm的长线形，基因组约19,300个核苷酸组成的正义单链RNA(+ssRNA)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。CTV存在多种基因型和复杂的株系分化现象，不同基因型的CTV分离株能引起包括茎陷点、酸橙作砧木的甜橙和葡萄柚植株快速死亡在内的多种症状。目前CTV被分为T3、VT、T30、T36、B165、RB、L1、M1、S1、HA165、T68、AT-1等10余种基因型，其中T30基因型CTV分离株为弱毒株系，T36基因型CTV分离株能引起柑橘植株的速衰症状，T3、VT、B165基因型CTV分离株主要引起苗黄症状，RB、HA基因型CTV分离株可能与茎陷点症状相关。为此，Hilf、Roy等人针对此现象设计了特异性引物并运用RT-PCR技术区分上述基因型CTV分离株，Yokomi等人根据CP基因设计的三种探针可区分T36、VT、T30基因型的CTV分离株。

申请人在前期研究中发现，CTV分离株中还存在一种新的基因型(RB-N1基因型)，RB-N1基因型的CTV分离株序列与目前报道的引起柑橘植株茎陷点症状的CTV的RB基因型分离株的序列同源性高达86.5％，因此RB-N1基因型CTV分离株对拓展研究CTV分离物基因型类型和在各柑橘产区的分布情况以及与CTV分离物引起柑橘植株症状间的相关性有重要意义。到目前为止，还没有关于CTV分离株RB-N1基因型的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒及其检测方法，对RB-N1基因型柑橘衰退病毒具有快速、高效、特异性强和灵敏度高的检测特点。

本发明提供了一种检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒的引物对，包括RB-N1F和RB-N1R2；

所述RB-N1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述RB-N1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种基于RT-PCR技术检测RB-N1基因型柑橘衰退病毒用试剂盒，包括所述引物对。

优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增用试剂和/或反转录用试剂。

优选的，所述PCR扩增用试剂包括普通PCR扩增用试剂或荧光PCR扩增用试剂；

所述荧光PCR扩增用试剂包括2×SYBR Green qPCRMix；

所述普通PCR扩增用试剂包括10×PCR-buffer、dNTPs和r-Taq酶。

优选的，所述反转录用试剂包括以下试剂中的一种或几种：解链液、5×RT-buffer、dNTPs、RNA酶抑制剂和反转录酶RTase。

本发明提供了所述引物对或所述试剂盒在检测植物感染RB-N1基因型柑橘衰退病毒中的应用。