[发明专利]一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条

说明书

本发明涉及分子检测技术领域，尤其是一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条，该方法通过在侧向层析试纸或附件上设置Cas蛋白和固定的标记探针，来实现侧向层析可视化检测，还可实现多指标联合检测。标记探针上含有相连的核酸探针和标记物，Cas蛋白上含可靶向待检测分子的引导序列，当检测样本中含有待检测分子，Cas蛋白被激活后切割标记探针中的核酸探针，从而使原本固定于侧向层析试纸或附件的标记物被释放。本发明将标记探针固定，被切割后标记物质才被释放并通过夹心法或捕获法试纸条进行检测，提高了检测的特异性，避免了现有技术中假阳性问题。

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，具体领域为一种基于CRISPR系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条。

背景技术

CRISPR分子检测是2017年由博德研究所张锋团队首先开发出来的新型分子检测技术，主要原理是利用Cas蛋白接触并结合靶向片段后，本身的无差别反式切割功能被激活，会切割附近一切核酸序列的特点，通过检测探针序列被切割情况从而判断靶向片段是否存在的一种检测方法(Gootenberg,Jonathan,S,et al.Nucleic acid detection withCRISPR-Cas13a/C2c2.[J].Science,2017.)。

2019年，张锋团队将CRISPR方法和侧向层析试纸结合起来推出了SHERLOCK技术(Kellner M J,Koob J G,Gootenberg J S,et al.SHERLOCK:nucleic acid detectionwith CRISPR nucleases[J].Nature Protocols,2019,14(10))。该方法在系统中引入了一段在两端分别标记生物素(Biotin)和荧光素(FAM)的探针序列。采用的侧向层析试纸条可以检测同时含有Biotin和FAM的序列：在近端的条带处包被有可结合Biotin的亲和素(SA)，在胶体金上标记有抗FAM抗体，另外远端还有一条条带，包被有可与抗FAM抗体结合的二抗。这是一种夹心法的试纸条，当样品中存在同时含有Biotin和FAM的序列时，会在近端的条带处形成SA-Biotin-探针-FAM-抗FAM抗体-胶体金复合物，从而显色。

张锋团队将该夹心法试纸条用竞争法方式使用。样本为阴性时，CRISPR系统未激活，探针完整，同时标记有生物素(Biotin)和荧光素(FAM)的探针序列不会被切割，所以，胶体金全部被试纸条近端的SA条带处通过夹心法被完全捕获，不会到达试纸条远端的线。

当样本为阳性时，两端分别标记有生物素(Biotin)和荧光素(FAM)的探针序列被切断，近端条带处不能形成SA-Biotin-探针-FAM-抗FAM抗体-胶体金复合物，胶体金越过近端条带到达远端条带显色，呈现为阳性结果。

在张锋团队开发的方法中，这种夹心法试纸条采用竞争法方式判读：当远端条带显色时候为阳性，远端条带不显色时候为阴性，这个远端条带是常规夹心法试纸条中的质控线。

2019年之后所有将CRISPR系统和试纸条结合的检测方法(比如STOPcovid、STOPcovid2、HOLMESv2)都采用同样的试纸条和判读方式。

在中国发明专利申请CN112708660A中，采用了将同样的探针固定到各种材质的微球载体上，在Cas蛋白反应的液相体系中加入微球，等反应结束之后分离微球，然后仍旧采用这种试纸条进行判读。