[发明专利]一种提取赤拟谷盗或雷氏黄萤线粒体的方法

说明书

本发明公开了一种提取赤拟谷盗及雷氏黄萤线粒体的方法，该方法是将赤拟谷盗成虫或雷氏黄萤幼虫组织匀浆后，采用差速离心和Nycodenz密度梯度离心的方法，获得纯化线粒体；本发明方法对线粒体的损伤小，提取的线粒体活性高，对线粒体以外的细胞核、内质网、细胞膜或胞浆蛋白组分等分离较为彻底；获得的线粒体具有高纯度、高活性等特性；这对后续的昆虫分子生物学实验的研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提取赤拟谷盗、雷氏黄萤高活性高纯度线粒体的方法。

背景技术

线粒体是控制细胞生死的中心细胞器，它们参与关键的代谢反应，合成大部分ATP，调节包括细胞凋亡在内的一系列信号通路，在生命过程中发挥重要的生理功能。线粒体作为动物的“能量工厂”，通过氧化磷酸化（OXPHOS）过程（即ATP的产生）产生95%的能量，在氧的利用、能量代谢和活性氧稳态中发挥重要作用。此外，线粒体还具有组织特异性，能够满足不同组织的生理需要，在真核生物的生长发育和先天免疫中发挥重要作用。越来越多的证据表明线粒体在神经退行性变、神经元形态发生和可塑性以及不育等病理生理过程中具有重要作用。近年来，随着生物技术的发展，线粒体的研究领域不断扩大，包括线粒体蛋白质组学、线粒体表观遗传学、自噬、线粒体进化生物学和线粒体分子疾病。线粒体结构和功能的研究通常是在分离的线粒体上进行的，因此从一定组织中获得高纯度高活性的线粒体是研究线粒体组织功能的关键。

昆虫是地球上最普遍、最多样化的动物群。在这一动物群体中，线粒体是用于研究进化、多样性、生态适应、发育和生长、杀虫剂抗性和免疫反应的主要目标之一。这些涉及线粒体作用的研究主要集中在线粒体DNA和蛋白质、细胞和组织水平。然而，线粒体细胞器水平的相关研究在昆虫中还没有记录。此外，与细胞质包裹的线粒体相比，直接暴露于生态胁迫和外源性物质的线粒体的变化和反应更为敏感和准确。总的来说，高纯度和功能活性的线粒体将使与线粒体相关的研究在昆虫中更加直接、准确和方便。本研究以赤拟谷盗、雷氏黄萤为昆虫代表获得高纯度、高活性的线粒体，为以昆虫线粒体为重点的研究奠定了基础。

目前对于动物组织线粒体的方法报道主要是针对于哺乳动物的细胞和组织中提取线粒体。很少有研究涉及特定的昆虫线粒体分离方法，关于可能污染线粒体制备甚至线粒体的整体质量和完整性的相关研究也知之甚少。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高活性、高纯度昆虫线粒体提取与纯化方法；研究了分离的昆虫线粒体的纯度、活性和膜完整性，实验结果表明Nycodenz分离线粒体的方法不仅可以去除污染线粒体的其他细胞器，提高线粒体的纯度，而且还不影响线粒体活性和线粒体完整性。本方法将为从鞘翅目昆虫中获得高纯度、高活性的线粒体提供了一个有价值的起点。

本发明提取赤拟谷盗、雷氏黄萤线粒体的方法如下：

（1）在赤拟谷盗成虫或雷氏黄萤幼虫中添加研磨缓冲液混匀后，匀浆，制得匀浆液，匀浆液在4℃、1000～1200g下离心5min，收集上清液在4℃、1000～1200g下离心5min，收集上清液在4℃、12000～15000g下离心10min，收集沉淀，得到粗提线粒体；

（2）将粗提线粒体用预冷至4℃的25% Nycodenz溶液2.4mL悬浮，得到粗提线粒体悬浮液，在离心管中将密度梯度介质铺层，即沿管壁缓慢依次加入密度梯度介质1mL 34%Nycodenz溶液、1.6mL30% Nycodenz溶液、2.4mL粗提线粒体悬浮液、1.6mL 23% Nycodenz溶液、0.6mL 20%Nycodenz溶液，然后进行密度梯度离心，收集处于20%和23%溶液之间条带的溶液，该溶液经4℃、12000～15000g离心10min，收集沉淀，即得纯化线粒体。

匀浆采用杜恩斯匀浆器使赤拟谷盗组织均匀化，松匀浆棒和紧匀浆棒各敲十下。

所述密度梯度离心是在4℃、100000 g下离心1～1.5 h。