[发明专利]L-半乳糖的合成方法

权利要求书

1.L-半乳糖的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

取半乳糖醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，调节体系pH值为7.5-8.0，加入甘露醇脱氢酶（agMDH）和NADH氧化酶（NoxE），25-37^oC反应6-12小时，生成L-半乳糖；

上述反应在三羟甲基氨基甲烷盐酸、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或 3-吗啉丙磺酸缓冲液中进行；

所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；

所述的NADH氧化酶是来源于闪烁梭菌(Clostridium scindens)的NADH氧化酶（ScNoxE）或者是来源于噬热栖热菌(Thermus thermophilus)的NADH氧化酶（TtNoxE）；若采用TtNoxE，则配合过氧化氢酶使用；

所述来源于闪烁梭菌(Clostridium scindens)的NADH氧化酶的氨基酸序列如SEQ.ID. NO. 2所示；

所述来源于噬热栖热菌(Thermus thermophilus)的NADH氧化酶的氨基酸序列如SEQ.ID. NO. 3所示。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述的甘露醇脱氢酶和NADH氧化酶，其酶活比为1:(2-3)。

3.L-半乳糖的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

取D-半乳糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，调节体系pH值为7.0-8.5，加入甘露醇脱氢酶（agMDH）和D-半乳糖还原酶（aldR），20-30℃反应5-12小时，生成L-半乳糖；

上述反应在三羟甲基氨基甲烷盐酸、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液或 3-吗啉丙磺酸缓冲液中进行；

所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；

所述D-半乳糖还原酶的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述的甘露醇脱氢酶和D-半乳糖还原酶，其酶活比为(2-3): 1。

5.根据权利要求1或3所述的合成方法，其特征在于：所述反应完成后，除去或回收酶，反应体系调节pH值至中性后过阴离子交换树脂除杂，再过渗透膜除盐后浓缩、结晶，得到L-半乳糖。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于：

所述的酶是液体酶或固定化酶；

若采用液体酶，则反应后调节反应体系pH值至强酸性，沉淀蛋白，并离心除去；

若采用固定化酶，则反应后过滤回收。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于：所述的固定化酶，由以下步骤制得：

按活力比将所需的酶混合溶解在50 mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40 mM苯氧乙酸以及LX-1000 EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌5小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及 25 mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用。