[发明专利]L-半乳糖的合成方法

说明书

本发明公开了L‑半乳糖的合成方法，包括以下步骤：取半乳糖醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，加入甘露醇脱氢酶和NADH氧化酶反应，生成L‑半乳糖；或者取D‑半乳糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐混合，加入甘露醇脱氢酶和D‑半乳糖还原酶反应，生成L‑半乳糖。本发明采用市面上廉价、大宗的D‑半乳糖或半乳糖醇作为原料，利用酶催化剂一步或者两步直接转化得到昂贵的L‑半乳糖。该制备方案具有多方面的工业应用优势，使用原料便宜、制备路线短、反应条件简单且废物排放低；以上这些特点都很好的符合了当今绿色工业生产的基本要求。

技术领域

本发明属于生物酶法合成领域，具体涉及L-半乳糖的合成方法。

背景技术

L-半乳糖(L-galactose)是自然界存在的一种稀有糖，它是常见D-半乳糖的L-构型。L-半乳糖存在于牛奶和甜菜中，也可由人体合成。L-半乳糖是潜在用于肾病综合征中局灶性和节段性肾小球硬化的口服治疗，它是多种生物活性皂苷(Saponin)的结构成分，这些皂苷被广泛应用于食品、化妆品及医药领域。与此同时，L-半乳糖也是多种L-核苷抗病毒类药物合成以及维他命C生物合成的基本原料。然而，其高昂的价格极大地限制了推广应用(国际知名的糖销售公司Carbosynth上的价格为：L-半乳糖￥2,300/克)。

目前L-半乳糖有多种制备方法，但都存在某些缺陷而导致其无法廉价、大规模生产应用。

在化学制备路线中，这个糖的合成需要经历多步的羟基保护、脱保护，这不仅导致其制备路线过长而且整体收率太低，同时由于制备过程中的手性消旋问题将极大地困扰后期产品的纯化。

发酵生产L-半乳糖则由于产物浓度及纯度都比较低，导致最终产品纯化成本太高而无法有效规模化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供L-半乳糖的合成方法，采用酶催化策略有效实现从廉价的D-半乳糖/半乳糖醇到L-半乳糖的直接转化，该制备路线短(一步或两步转化)，反应条件简单，转化率高，所以无论是在生产成本以及环境保护方面都具有显著的优势。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

L-半乳糖的合成方法，包括以下步骤：

取半乳糖醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺)混合，调节体系pH值为7.5-8.0，加入甘露醇脱氢酶(agMDH)和NADH氧化酶(NoxE)，20-37℃反应6-12小时，生成L-半乳糖；

所述的甘露醇脱氢酶和NADH氧化酶，其酶活比为1:(2-3)；

所述的NADH氧化酶可以是来源于闪烁梭菌(Clostridium scindens)的NADH氧化酶(简称ScNoxE，氧化产物是H₂O，Uniprot ID:B0NJW3,EC 1.6.3.1)(也即SEQ.ID.NO.2)，或者是来源于噬热栖热菌(Thermus thermophilus)的NADH氧化酶(简称TtNoxE，氧化产物是H₂O₂，Uniprot ID:Q60049,EC 1.6.99.3)(也即SEQ.ID.NO.3)；

若采用TtNoxE，则需配合过氧化氢酶(Catalase)使用；一般地，过氧化氢酶与TtNoxE的酶活比为(0.25-1.2):1，优选1:3。

优选地，所述的反应可以加压进行，特别优选在1.5个大气压下反应；

所述的甘露醇脱氢酶(agMDH)，野生型(Uniprot ID:Q38707,EC 1.1.1.255)来源于芹菜(Apium graveolens)，经过本发明基因改造提高了其在大肠杆菌内的酶表达及其稳定性，突变位点是：F14I，S47C，N93Y，T301S，S343G，其改造后的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。