[发明专利]L-塔格糖的合成方法

权利要求书

1.L-塔格糖的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取半乳糖醇与三磷酸腺苷二钠盐ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、镁盐和钾盐混合，调节体系pH值为7.0-8.5，加入半乳糖醇脱氢酶(GatDH)、己酮糖激酶(TgK)，室温下反应4-10小时，然后加入草酸钡，搅拌溶解后加入无水乙醇混合沉淀L-塔格糖-6-磷酸，离心收集白色固体沉淀；白色固体沉淀复溶除去Ba²⁺离子，并进一步纯化后得到L-塔格糖-6-磷酸；

(2)取L-塔格糖-6-磷酸，加入磷酸水解酶(APase)，20-30℃反应2-5小时生成L-塔格糖。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)中同时加入乳酸脱氢酶(LDH)、乙酸激酶(AcK)、丙酮酸钠，和乙酸磷酸溶液。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述的白色固体沉淀复溶除去Ba²⁺离子，是将白色固体沉淀溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，加入无水硫酸钠与Ba²⁺离子反应，生成白色硫酸钡沉淀，过滤除去。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)所述的进一步纯化，是将除去Ba²⁺离子后的上清液调pH值至中性，上样阴离子树酯交换柱，用梯度浓度碳酸氢氨水溶液洗脱分离得到L-塔格糖-6-磷酸。

5.L-塔格糖的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

取D-半乳糖和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH)混合，调节溶液pH值为6.5～8.5，加入D-半乳糖还原酶(aldR)和半乳糖醇脱氢酶(GatDH)，20-27℃反应4-10小时，生成L-塔格糖；

所述D-半乳糖还原酶的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

6.根据权利要求1或5所述的合成方法，其特征在于：所述反应完成后，除去或回收酶，反应液过阴离子交换树脂除杂，然后除盐、浓缩、结晶，得到L-塔格糖。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于：所述的酶是液体酶或固定化酶。

8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于：

若采用液体酶，则反应后调节反应体系pH值至强酸性，沉淀蛋白，并离心除去；

若采用固定化酶，则反应后过滤回收。

9.根据权利要求1或5所述的合成方法，其特征在于：所述的反应物加入到三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)缓冲液或3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液中反应。

10.根据权利要求7或8所述的合成方法，其特征在于：所述的固定化酶，由以下步骤制得：

将所需的酶混合或单独溶解在50mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40mM苯氧乙酸以及LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌5小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用。