[发明专利]L-塔格糖的合成方法

说明书

本发明公开了L‑塔格糖的合成方法，将半乳糖醇在氧化酶GatDH以及激酶TgK联合作用下转化成L‑塔格糖‑6‑磷酸，然后利用磷酸水解酶APase去磷酸得到L‑塔格糖；或者D‑半乳糖通过还原酶aldR还原成半乳糖醇，然后半乳糖醇通过氧化酶GatDH可转化成L‑塔格糖。本发明采用廉价大宗的D‑半乳糖或半乳糖醇作为原料，利用多个酶连续转化得到昂贵的L‑塔格糖。该制备方案具有多方面的工业应用优势，使用原料便宜、制备路线短、反应条件简单且废物排放低；以上这些特点都很好的符合了当今绿色工业生产的基本要求。

技术领域

本发明属于生物酶法合成领域，具体涉及L-塔格糖的合成方法。

背景技术

L-塔格糖(L-tagatose)是自然界中存在的一种稀有糖，其也是一种低热量的功能性甜味剂，更是多种洗涤剂、化妆品以及药物的添加剂。与此同时，L-塔格糖也是半乳糖苷酶抑制剂(L-deoxygalactonojirimycin)合成的原料，在癌症的化疗方面也有其特殊的作用。然而，其高昂的价格限制了推广应用(国际知名的糖销售公司Carbosynth上的价格为：L-塔格糖￥20,000/克)。

迄今报道的L-塔格糖的制备有多种方法，但都存在某些缺陷而导致其无法廉价、大规模生产应用。

在化学制备路线中，L-塔格糖的合成需要经历多步的羟基保护、脱保护，这不仅导致其制备路线过长而整体收率太低，同时由于制备过程中的手性消旋问题将极大的困扰后期产品的纯化。

发酵生产L-塔格糖则由于产物浓度及纯度都比较低，导致最终产品纯化成本太高，而无法有效规模化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供L-塔格糖的合成方法，通过多级酶联催化实现了从廉价的半乳糖醇或D-半乳糖到L-塔格糖的直接转化，该制备路线短,反应条件简单，转化率高，所以无论是在生产成本以及环境保护方面都具有显著的优势。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

L-塔格糖的合成方法，包括以下步骤：

(1)取半乳糖醇与三磷酸腺苷二钠盐ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、镁盐和钾盐混合，调节体系pH值为7.0-8.5(反应过程中维持该pH值范围)，加入半乳糖醇脱氢酶(GatDH)、己酮糖激酶(TgK)，室温下反应4-10小时，然后加入草酸钡，搅拌溶解后加入无水乙醇混合沉淀L-塔格糖-6-磷酸，离心收集白色固体沉淀；白色固体沉淀复溶除去Ba²⁺离子，并进一步纯化后得到L-塔格糖-6-磷酸；

(2)取L-塔格糖-6-磷酸，加入磷酸水解酶(APase)，20-30℃反应2-5小时生成L-塔格糖；

优选地，步骤(1)中还可以同时加入乳酸脱氢酶(LDH)、乙酸激酶(AcK)、丙酮酸钠，和乙酸磷酸溶液，利用乳酸脱氢酶(LDH)将NADH转化成NAD⁺，乙酸激酶(AcK)将ADP再生成ATP，从而降低辅酶和ATP的用量；

其中，半乳糖醇脱氢酶(GatDH)、己酮糖激酶(TgK)、乳酸脱氢酶(LDH)与乙酸激酶(AcK)的酶活比为2:(3-5):(1-3):(3-8)，优选2:4:1.5:5。

其中，半乳糖醇与丙酮酸钠的摩尔比为(0.90-1.15):1；其他的几种原料，或者是酶的底物，或者是酶起活性所需盐类，其所需用量较少；

步骤(1)所述的白色固体沉淀复溶除去Ba²⁺离子，是将白色固体沉淀溶解在pH值1.0的Tris缓冲溶液中，加入无水硫酸钠与Ba²⁺离子反应，生成白色硫酸钡沉淀，过滤除去；

步骤(1)所述的进一步纯化，是将除去Ba²⁺离子后的上清液调pH值至中性，上样阴离子树酯交换柱，用梯度浓度碳酸氢氨水溶液(0-1N)洗脱分离得到L-塔格糖-6-磷酸。