[发明专利]一种应用于里氏木霉的CRISPR/Cas基因编辑系统

权利要求书

1.一种应用于CRISPR/Cas基因编辑系统的gRNA表达框，其特征在于，所述gRNA表达框从5’-3’具有以下结构：A-B-C-D，其中A为具有起始gRNA转录作用的病毒序列，B是gRNA，C为gRNA backbone，D为肝炎病毒核酶(HDV)序列。

2.根据权利要求1所述的gRNA表达框，其特征在于，所述的具有起始gRNA转录作用的病毒序列选自烟草环点病毒(TRSV)序列、筷子芥花叶病毒(ARMV)序列、菊苣黄色斑点病毒(CYMVT)序列、锤头状病毒(HH)序列中的一种。

3.根据权利要求1所述的gRNA表达框，其特征在于，所述的具有起始gRNA转录作用的病毒序列选自烟草环点病毒(TRSV)序列、筷子芥花叶病毒(ARMV)序列、菊苣黄色斑点病毒(CYMVT)序列中的一种，gRNA序列是根据靶基因一个或者两个以上位点合成的互补序列。

4.一种CRISPR/Cas基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包含权利要求1-3任一所述的gRNA表达框，所述的CRISPR/Cas基因编辑系统是CRISPR/Cas9、CRISPR/nCas9或者CRISPR/dCas9。

5.根据权利要求4所述的基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas基因编辑系统是CRISPR/Cas9。

6.一种权利要求4-5任一所述的CRISPR/Cas基因编辑系统在里氏木霉基因编辑和转录调控中的应用，所述基因编辑包括基因敲除、基因插入中的一种。

7.一种基因编辑方法，所述方法是利用权利要求4-5任一所述的CRISPR/Cas基因编辑系统对里氏木霉进行基因编辑和转录调控，所述基因编辑包括基因敲除、基因插入中的一种。

8.一种里氏木霉，所述里氏木霉通过如下方法制备得到：(1)利用本发明所述的CRISPR/Cas基因编辑系统对里氏木霉进行基因编辑，并将转化子涂布至筛选培养基中进行筛选；(2)挑选转化株；(3)筛选得到阳性转化株；(4)筛选得到基因敲除成功的阳性转化株；(5)通过摇瓶发酵筛选得到高产里氏木霉。

9.根据权利要求8所述的里氏木霉，其特征在于，所述步骤(1)中的筛选培养基为增强筛选培养基，所述增强筛选培养基是在筛选培养基的成分中添加0.5-1.5g/L甜菜碱和10-15mL/L蒲公英浸出液。

10.根据权利要求9所述的里氏木霉，其特征在于，所述增强筛选培养基是在筛选培养基的成分中添加1g/L甜菜碱和10mL/L蒲公英浸出液。