[发明专利]一种应用于里氏木霉的CRISPR/Cas基因编辑系统

说明书

本发明提供一种应用于CRISPR/Cas基因编辑系统的gRNA表达框，所述gRNA表达框从5’‑3’具有以下结构：A‑B‑C‑D，其中A为具有起始gRNA转录作用的病毒序列，B是gRNA，C为gRNA backbone，D为肝炎病毒核酶(HDV)序列，所述gRNA表达框可在里氏木霉体内被RNA聚合酶II启动子识别并转录。本发明首次在里氏木霉中实现了Cas9和gRNA的同时体内转录，避免gRNA体外转录后再转化的复杂性和不稳定性等弊端。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于里氏木霉CRISPR/Cas基因编辑系统的gRNA表达框，以及包含所述gRNA表达框的CRISPR/Cas基因编辑系统。

背景技术

全球经济体系的发展一直取决于化石能源的开发，然而，化石能源是有限的，是短期内不可再生的一次性资源。对于化石能源的依赖，不仅给人类社会带来潜在的能源危机，还引发了一系列的生态、环境问题。因此，越来越多的研究开始着力于寻找能够替代化石能源的原料及其使用方法。木质纤维素生物质是地球上数量最大的可再生资源，可作为化石能源的替代材料，越来越广泛的应用于全球新兴的生物炼制体系发展中。木质纤维素材料转化为生物质能源和新材料，需要经过的必要关键步骤是利用纤维素酶将木质纤维素材料酶解成可发酵糖，之后才可进行发酵、加工，生产出生物乙醇等能源和化学品。因此，对于纤维素酶的研发非常重要。目前，生产纤维素酶最常用的菌株是里氏木霉，但其产酶能力还远达不到工业产酶需求，亟需进一步的针对性改造。

CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列是生命进化历史上细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务。细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR/Cas9系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统。

CRISPR/Cas9是一种新型的、功能强大的基因编辑工具，2012年被开发后，迅速应用于真核基因组编辑领域，实现了哺乳动物细胞、酵母和丝状真菌的编辑。其原理是：Cas9蛋白可在引导RNA(gRNA)的引导下对目标位点进行切割编辑，以达到物种基因改造的目的。对于该系统来说，gRNA和Cas9的表达方式有三种，其一是两者同时在目标物种内表达，其二是Cas9在物种内表达，gRNA在体外转录后再额外转化，其三是两者同时在体外合成核糖核蛋白复合体后再额外转化。其中，两者同时的体内表达具有很大优势，可以避免gRNA体外转录不稳定及额外单独转化Cas9以及gRNA的操作复杂性等弊端。

目前CRISPR/Cas9技术在里氏木霉中应用基因编辑技术尚未成熟，虽然已公开过用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编辑基因方法，但该技术是体内表达Cas9，体外转录gRNA后进行额外转化的方法对里氏木霉应用CRISPR-Cas9基因编辑技术。比如，周志华等首次在丝状真菌里氏木霉中测试CRISPR/Cas9系统的可行性时，由于真菌小RNA转录机制认识的缺乏，不得不采用向导RNA体外转录然后再转化至细胞的方法。虽然向导RNA体外转录后以RNA的形式也可导入细胞中，引导Cas9蛋白的定位，但向导RNA的稳定性与转化效率会影响基因组编辑效率，且增加操作难度。

造成这一现状的原因是由于在里氏木霉中暂未发现常用于gRNA转录的U3或U6等启动子，因此实现gRNA和Cas9的同时体内转录仍是一个关键问题。为了克服现有技术的缺陷，本发明构建了一套新型的CRISPR-Cas9基因编辑系统，首次实现了在里氏木霉中Cas9和gRNA同时体内转录，避免gRNA体外转录后再转化的复杂性和不稳定性等弊端。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于里氏木霉CRISPR/Cas基因编辑系统的gRNA表达框，本发明的另一个目的是提供一种包含所述gRNA表达框的CRISPR/Cas基因编辑系统及其构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。