[发明专利]基因组DNA序列中缺碱基位点的均相荧光定量检测方法

权利要求书

1.一种基因组DNA序列中缺碱基位点的定量检测方法，包括以下步骤：

1)制备5’末端为羟胺修饰的寡脱氧核苷酸链即X链；

2)通过T4 PDG处理将基因组DNA序列的缺碱基位点酶解为5’末端暴露醛基结构，然后加入X链进行共价标记反应；

3)在共价标记反应结束后，加入辅助链Y链和未与缺碱基位点反应的多余X链杂交，所述Y链与游离的X链杂交形成X链5’末端的2个核苷酸错配打开、其余部分匹配的双链DNA结构，利用Lambda核酸外切酶将多余X链水解除去，然后加热使Lambda核酸外切酶失活；

4)在步骤3)除去多余X链的反应产物溶液中加入P链杂交，所述P链为两端分别标记有荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸探针，与共价标记在缺碱基位点上的X链杂交形成P链5’末端的2个核苷酸错配打开、其余部分匹配的双链DNA结构，然后加入Lambda核酸外切酶，P链被快速水解发出荧光信号，实时采集荧光信号；

5)通过检测反应溶液荧光信号上升的速率对样品中缺碱基位点的含量进行准确定量。

2.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤1)中所述X链的长度为14～16nt。

3.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤1)将5’末端磷酸骨架上修饰了叠氮基团的寡脱氧核苷酸链和N-(炔丙氧基)邻苯二甲酰亚胺在硫酸铜/抗坏血酸钠催化下通过炔-叠氮环加成点击化学反应得到X链。

4.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤1)炔-叠氮环加成点击化学反应的缓冲液为磷酸缓冲液，并加入配体三-(3-羟基丙基三唑基甲基)胺提高铜的催化效率。

5.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤2)T4 PDG酶解反应后加入X链，在磷酸缓冲液中室温下进行共价标记反应1.5～2小时。

6.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤3)先加入Y链和Lambda核酸外切酶反应缓冲液，充分混匀后静置使Y链和X链杂交，然后加入Lambda核酸外切酶孵育一段时间，最后加热至90℃使Lambda核酸外切酶失活。

7.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤4)中所述P链在5’末端标记荧光基团，在3’末端标记猝灭基团。

8.如权利要求7所述的定量检测方法，其特征在于，所述荧光基团和相应的猝灭基团选自下列组合中的一种：FAM和BHQ1/DABCYL/TAMRA，TET和BHQ1/DABCYL，HEX和BHQ1/BHQ2/DABCYL，TAMRA和BHQ2，ROX和BHQ2，Texas Red和BHQ2，Cy5和BHQ2/BHQ3。

9.如权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，通过步骤4)采集的荧光强度随时间变化的曲线测得待测样品的荧光上升速率，在步骤5)根据由标准样品获得的荧光上升速率与缺碱基位点浓度进行线性拟合得到的标准曲线，计算待测样品中缺碱基位点的含量。

10.一种基因组DNA序列中缺碱基位点的定量检测试剂盒，包括三种寡核苷酸链：X链、Y链和P链，T4 PDG酶及其工作缓冲液，Lambda核酸外切酶及其工作缓冲液；其中，所述X链是5’末端为羟胺修饰的寡脱氧核苷酸链；所述Y链能与X链杂交形成X链5’末端的2个核苷酸错配打开、其余部分匹配的双链DNA结构；所述P链是两端分别标记有荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸探针，其能与X链杂交形成P链5’末端的2个核苷酸错配打开、其余部分匹配的双链DNA结构。