[发明专利]基因组DNA序列中缺碱基位点的均相荧光定量检测方法

说明书

本发明公开了基因组DNA序列中缺碱基位点的均相荧光定量检测方法，通过共价连接反应将已知序列寡核苷酸链共价标记到缺碱基位点，利用Lambda核酸外切酶及对应荧光探针实现对基因组DNA序列中缺碱基位点的定量检测。本发明操作简便，灵敏度高，所需生物样品量小，能够方便、快速、灵敏、准确地测定生物样品中缺碱基位点的含量，在与DNA损伤和修复相关的生物医学研究、临床诊断和药物开发评价等方面都具有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因组脱嘌呤/脱嘧啶位点(简称缺碱基位点，用AP表示)的分析检测领域，更具体地，涉及一类核酸外切酶-寡聚核苷酸荧光探针联用反应体系，以及利用该荧光探针定量检测细胞裂解液、血细胞液等样品中缺碱基位点含量的方法。

背景技术

脱嘌呤/脱嘧啶位点(apurinic/apyrimidinic site)统称为缺碱基位点(abasicsite，简称AP位点)，是一种常见的基因组DNA损伤。缺碱基位点主要通过细胞内自发的糖苷键水解产生，该位点失去碱基后，仅有糖环和磷酸骨架结构。据估计，每个人类细胞每天在生理条件下自发水解产生的缺碱基位点可达10000-50000个。除此之外，碱基切除修复过程以及一些外源性的损伤因素如紫外线、电离辐射或细胞所处环境酸化等也会造成不同程度的碱基脱落从而形成缺碱基位点。

由于缺碱基位点丢失了碱基结构这个关键的遗传信息，会阻碍DNA的复制和转录。若未被及时修复，会产生细胞毒性，诱发基因突变，造成细胞凋亡。碱基切除修复(BER)是AP位点和其他类型碱基损伤的主要修复途径。AP位点既是一种DNA直接损伤的产物，也是其他类型碱基损伤在碱基切除修复过程中的重要中间体。细胞内基因组DNA中的AP位点含量水平和序列分布与衰老及多种疾病特别是癌症的发生和发展密切相关。目前已发现帕金森综合征、阿尔茨海默症以及部分癌症患者细胞中AP位点的含量均较高。另一方面，通过诱导癌细胞产生大量碱基损伤，并对缺碱基位点这一BER重要中间体进行修饰，从而抑制损伤修复进行癌症治疗的方法也多有报道。因此，对细胞基因组DNA的缺碱基位点含量进行定量测定，有助于监测人体的健康状况，评估药物治疗效果，同时对深入研究BER过程的重要影响因素以及发现新的药物靶点也具有积极的促进作用。