[发明专利]一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法

说明书

本发明涉及一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，包括以下步骤：取生物样品，加入三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为C18色谱柱，所述C18色谱柱的粒径为1.6～2.2μm，所述C18色谱柱的长度为40～60mm。本发明的检测方法不仅能同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，且特异性强，针对维生素K1、MK4和MK7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，基线低，基质干扰少，方法检测限低，灵敏度高，且稳定性强。

技术领域

本发明涉及分析领域，特别是涉及一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法。

背景技术

维生素K是2-甲基-1,4-萘醌及其衍生物的总称，目前已发现的天然脂溶性维生素K有两种：一种是在苜蓿中提出的油状物—维生素K1(VK1)，又称叶绿醌；另一种是在腐败鱼肉中获得结晶体维生素K2。维生素K2包括几种不同的形式，人类饮食中最常见的维生素K2形式为甲萘醌-4(MK4)和甲萘醌-7(MK7)。MK4主要存在于动物产品中，如蛋黄、肉、肝和黄油。MK7则由细菌合成，主要存在于发酵食品中。

维生素K又称凝血维生素，是合成各种凝血因子的必要辅助因子，在血液稳态中起不可或缺的作用。各种研究表明，缺乏维生素K会导致血液中活跃的凝血因子浓度降低，从而导致出血。此外维生素K营养状况也与骨质疏松症有关。人类流行病学和干预研究表明，维生素K可以减少骨质疏松症患者的骨质流失，降低骨折风险。另有研究表明，维生素K2可抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，并诱导肝细胞癌、卵巢癌等多种实体瘤和血液系统疾病的细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤作用，且与多种抗肿瘤药物有协同作用。临床给与维生素K2补充治疗干预，可降低肿瘤发生风险。因此，体液中VK1、MK4和MK7的精准检测是膳食摄入、营养状况和疾病诊断治疗监测的重要指标。准确灵敏地测定生物样品中VK1、MK4和MK7的含量具有十分重要的意义。

但是，目前国内外关于维生素K的研究主要集中在VK1的检测上。目前尚未有同时检测多种样品类型中VK1、MK4和MK7的报道。

发明内容

由于VK1、MK4和MK7具有相同的2-甲基-1,4-萘醌环，经过质谱三重四级杆筛选和碰撞后，三种化合物产生相同的定量离子(质荷比187)，因此三种化合物在质谱检测上容易相互影响，导致检测结果不准确。同时MK7在结构上由于含有相对较长的类异戊二烯链，理化性质上和VK1、MK4相差较大。已有的文章报道关于MK7的检测，皆存在检测时间过长，基线高，目标物响应极低的情况，同时由于基质干扰严重，MK7检测稳定性差。VK1和MK4理化性质较为接近，在色谱行为上表现较为一致，一般检测方法较难以将两者在色谱上实现分离，导致检测结果互相干扰。

基于此，本发明的目的是提供一种能同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法。本发明方法特异性强，针对维生素K1、MK4和MK7都获得良好的色谱分离度(保留时间相差大于0.5min)，可避免由于相同的定量子离子产生的定量干扰；同时本方法在各种样品类型检测中，检测结果基线低，基质干扰少，质谱通道无干扰。由于维生素K2在各种生物样品类型中的含量较低，本方法检测限低，灵敏度高，稳定性强，可同时提供VK1、MK4和MK7的精准检测。

具体技术方案如下：

一种同时检测维生素K1、MK4和MK7的方法，包括以下步骤：

取生物样品，加入包含三种待测物的同位素内标混合溶液，再加入提取溶剂提取，离心，取上清液干燥后用复溶液溶解，得到待测样品，采用液相色谱串联质谱法检测；

所述液相色谱串联质谱法所采用的色谱柱为C18色谱柱，所述C18色谱柱的粒径为1.6～2.2μm，所述C18色谱柱的长度为40～60mm。

在其中一些实施例中，所述色谱柱的粒径为1.6～2.0μm，进一步为1.6～1.9μm，更进一步为1.6～1.8μm。