[发明专利]一种染色质外环状DNA的检测方法

说明书

本发明提供一种染色质外环状DNA的检测方法，将eccDNA作为肿瘤患者的液体活检标记物，通过线性DNA的去除、eccDNA的纯化、建库、测序，生物信息分析对反式剪切位点(junctionsite)的识别从而完成对eccDNA的鉴定与分析，本发明的方法未来可以为肿瘤患者用药、预后等精准医疗方案提供有效的信息。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种对eccDNA的鉴定与分析的染色质外环状DNA的检测方法。

背景技术

染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA)，简称eccDNA，目前研究认为eccDNA来源于基因组DNA，且不携带端粒和着丝粒，eccDNA的大小从100bp到数百万bp不等。前沿的研究表明，eccDNA的产生与扩增是肿瘤细胞的标志性事件，是肿瘤细胞中原癌基因高表达和高突变的来源。因此，针对肿瘤细胞eccDNA的鉴定方法是领域内关键技术方法。然而，目前领域内尚缺乏成熟的、稳定的从血液中提取和分离的方法。有研究表明，肿瘤组织和正常组织均会释放eccDNA进入循环系统，eccDNA在循环系统中的生物稳定性优于线性DNA，且具有独特的分子结构，可以将其作为液态活检检测靶标。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种染色质外环状DNA的检测方法，将eccDNA作为肿瘤患者的液体活检标记物，通过线性DNA的去除、eccDNA的纯化、建库、测序，生物信息分析对反式剪切位点(junction site)的识别从而完成对eccDNA的鉴定与分析，本发明的方法未来可以为肿瘤患者用药、预后等精准医疗方案提供有效的信息。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种染色质外环状DNA的检测方法，所述检测方法以eccDNA作为液态检测靶标，通过线性DNA的去除，ECCDNA的纯化、建库，测序与生物信息分析对反式剪切位点识别从而完成对eccDNA的鉴定与分析。

作为本发明的一种优选方案，所述检测方法包括以下步骤：

1)获取样本，富集样本中游离DNA；

2)利用酶切去除步骤1)的游离DNA中的线性DNA，保留eccDNA；

3)利用转座酶打断步骤2)的环状DNA，插入adaptor，进行扩增，建立文库；

4)对步骤3)的文库进行测序并鉴定相关eccDNA数目和染色质区域。

作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，所述酶切为利用核酸外切酶进行酶切。

作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn9以及Tn10中的一种或任意多种的组合。

作为本发明的一种优选方案，所述步骤3)中，扩增包括第一轮PCR扩增、qPCR扩增与第二轮PCR扩增。

作为本发明的一种优选方案，所述第二轮PCR扩增的循环数由qPCR扩增结果决定。

作为本发明的一种优选方案，所述样本包括肿瘤患者外周血样本。

作为本发明的一种优选方案，步骤4)中测序基于二代测序平台。

本发明所述的染色质外环状DNA的检测方法在监测肿瘤患者用药上的应用。

本发明所述的染色质外环状DNA的检测方法在监测肿瘤患者预后eccDNA上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：