[发明专利]一种间充质干细胞药物的基因编辑方法及应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞药物的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑方法包括以下步骤：

1）制备表达Cas9工程化血管内皮细胞；

2）收集步骤1）制备的Cas9工程化血管内皮细胞分泌的工程化微囊泡；

3）将引导靶向切割目标基因位点sgRNA和供体基因序列导入步骤2）获得的工程化微囊泡得到具有基因编辑功能的微囊泡；

4）将步骤3）得到具有基因编辑功能的微囊泡与间充质干细胞孵育即得干细胞药物。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞药物的基因编辑方法，其特征在于，所述步骤1）的Cas9工程化血管内皮细胞的制备方法包括：使用pLenti-CRISPR-V2，pMDLg/pRRE和pRSV-Rev慢病毒包装质粒转染宿主细胞，收获病毒后，感染血管内皮细胞，随后用嘌呤霉素筛选3-5代，获得Cas9稳定表达的Cas9⁺EPC细胞株。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞药物的基因编辑方法，其特征在于，所述步骤2）的收集Cas9工程化血管内皮细胞分泌的工程化微囊泡的步骤为：收集Cas9工程化血管内皮细胞的培养液上清，进行梯度离心去除细胞、细胞碎片、凋亡小体，将处理后的上清液通过超速离心，获得MVs沉淀，重悬MVs、超速离心、洗涤浓缩，重悬即得。

4.根据权利要求1~3任一项所述的间充质干细胞药物的基因编辑方法，其特征在于，所述步骤3）中通过电转染的方式将引导靶向切割目标基因位点sgRNA和供体基因序列载入微囊泡中，所述转染条件为：电压1000~1200V，时间间隔10-15ms，2-5个脉冲。

5.权利要求1~4任一项所述的基因编辑方法得到的干细胞药物。

6.一种Cas9⁺EPC细胞株，其特征在于，所述Cas9⁺EPC细胞株的制备方法如下：使用pLenti-CRISPR-V2，pMDLg/pRRE和pRSV-Rev慢病毒包装质粒转染宿主细胞，收获病毒后，感染血管内皮细胞，随后用嘌呤霉素筛选3-5代，获得Cas9稳定表达的Cas9⁺EPC细胞株。

7.权利要求1~4任一项所述的基因编辑方法或权利要求5所述的干细胞药物或权利要求6所述的Cas9⁺EPC细胞株在制备治疗糖尿病、高血糖症、糖尿病足或糖尿病并发症相关药物中的应用。