[发明专利]一种间充质干细胞药物的基因编辑方法及应用

说明书

本发明公开了一种间充质干细胞药物的基因编辑方法及应用，本发明应用该方法制备出葡萄糖水平敏感的能够治疗糖尿病高血糖症的基因工程干细胞药物，操作简便，安全性高。本发明发现使用Cas9+血管内皮细胞分泌囊泡能将目的基因转染进入MSC内，高效地通过Crispr‑Cas9基因编辑系统实现精确编辑，增强其功能的同时保留MSC免疫调节和促生长特性的方法。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种细胞基因编辑技术，具体涉及一种间充质干细胞药物的基因编辑方法及应用。

背景技术

近年来干细胞治疗取得了猛进的发展，作为一种替代医学方案，效果已经得到了普遍认可。其中，间充质干细胞(MSCs)得到了广泛而深入的研究，国际细胞疗法学会(ISCT)给出了间充质干细胞的鉴定标准：1.贴壁生长；2.表面特异性抗原(Ag)表达：CD105，CD73，CD90阳性，而CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79α，CD19和HLA-DR阴性；3.具有体外分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞等三种细胞类型的能力。与其他干细胞相比，MSC具有许多特殊优势，例如，不存在伦理问题；易于从脂肪、骨髓和脐带中获取；一定的分化潜能(分化为脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞，成肌细胞等，良好的增殖率以良好的临床应用安全性。

MSC可以迁移到损伤部位，发挥免疫调节作用以及通过特异性分化修复损伤组织。因此，广泛用于实验和临床研究以及基因工程中，比如骨骼，心脏，软骨，中枢神经，皮肤等组织器官的再生修复，具有广阔的应用前景。然而，MSC本身的局限性也限制了其治疗功效。这些局限型包括：体内分化效率低，归巢率低，某些因子表达不足以及移植后细胞活力降低等。例如，在糖尿病的治疗中，MSC回输后几乎找不到MSC分化为β细胞的证据。然而，大量的实践证明，MSC本身具有一定的微环境稳态维持和修护能力，特别是能够抑制局部过激的免疫反应，保证自生的长期存活和防止β细胞的进一步衰竭，从而产生自身长期存活和改善生理微环境的双重效果。如果能特异性增强MSC某一方面的治疗功能并保持其自身免疫调节以及生长因子分泌的优势，是MSC治疗的一个巨大飞跃。

基因组编辑为此提供了解决方案。基因组编辑是目前基因治疗领域最热门的方法之一，使用可编程嵌合核酸酶(锌指核酸内切酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)和规律成簇间隔短回文重复序列相关系列(CRISPR/Cas))诱导DNA双链断裂，通过非同源端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源定向修复(homology-directedrepair，HDR)对细胞内DNA进行特异性序列修饰。相对于成本高昂的ZENs和TALENs(需特殊定制相应目标DNA对应的蛋白质-DNA结合域)，CRISPR/Cas基于更简单的RNA引导DNA识别介导基因操纵，促进了低成本、高通量和多样化的遗传和表观遗传编辑，为探测基因功能和纠正突变提供了有力工具。同时，近年来，各种基因组编辑技术的出现为生物学家和研究人员提供了多种将序列特异性修饰引入细胞基因组的方法。包括：1.非病毒方法：物理方法(电动，显微注射，质粒注射，弹道注射)和化学方法(基于脂质体的方法，磷酸钙，DEAE葡聚糖，基于蛋白质的方法)；2.病毒方法：RNA病毒(逆转录病毒，HIV(慢病毒)和DNA病毒(腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，单纯疱疹病毒)等。

利用基因编辑的方法对MSC进行改造，增强其治疗功能，并维持其免疫调节和促进集体修复的特性，有助于MSC细胞药物的研制开发。然而，间充质干细胞由于其自身特性，采用常规方法施行基因转染成功率较低，且衰老速度快，丧失了作为细胞药物的意义。如果发展出一种可以高效精准进行基因编辑，维持其干性状态、免疫调节能力和生长因子分泌能力的方法，对基于间充质干细胞的基因工程化细胞药物治疗发展有重要意义。

发明内容

发明目的：为了使MSC增强对特定疾病的治疗功能并维持其免疫调节和促生长特性，本发明提供一种MSC基因编辑方法可以高效的将目的基因转染进入MSC内，同时保留MSC免疫调节和促生长特性的方法从而获得了干细胞药物。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述方法得到的干细胞药物。