[发明专利]靶向小鼠Atp7b基因的gRNA及构建Wilson疾病小鼠模型的方法

权利要求书

1.一组靶向小鼠Atp7b基因的gRNA，其特征在于，包括三条gRNA，其核酸序列分别为：

gRNA1=SEQ ID NO 1=5’ -GGCACCCAGGCCAAATGTAGGGG-3’；

gRNA2=SEQ ID NO 2=5’ -GACTCTTACCACTGCTAAGTGGG-3’；

gRNA3=SEQ ID NO 3=5’ -TCTTTGCTAAGGAGTAAAACTGG-3’。

2.一种靶向小鼠Atp7b基因的基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1中的一组靶向小鼠Atp7b基因的gRNA。

3.使用如权利要求1所述的一组靶向小鼠BBS５基因的gRNA构建Wilson 疾病小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用gRNA1、gRNA2、gRNA3将小鼠Atp7b基因敲除。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA1靶向切割小鼠Atp7b基因Exon2的5’端，gRNA2和gRNA3靶向切割Exon20的3’端。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2、gRNA3将Atp7b基因第2～第20个外显子之间的33183bp的DNA切除。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将Cas9 mRNA以及针对Atp7b基因合成的3条gRNA混合后注射到培养于M2培养基中具有双核清晰的受精卵的细胞核中；

2）注射后的受精卵培养在特定的培养基中，培养至3.5天后每15-20个囊胚移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；

3）仔鼠出生后5天即可剪鼠尾提取DNA进行PCR扩增鉴定并送测序，若有检测结果为阳性则表示小鼠基因敲除成功。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序引物为：

PCR测序引物=SEQ ID NO 4=5’- GTGGAAGAGAGGAGATGGTAAAC -3’。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：

PCR Primers1，其序列分别为：

F1=SEQ ID NO 5=5’- GTGGAAGAGAGGAGATGGTAAAC -3’；

R1= SEQ ID NO 6=5’- CATGGTTCAAGTTCACATAGTCCAG -3’。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：

PCR Primers2，其序列分别为：

F2=SEQ ID NO 7=5’- TCAGCTCAAGTGGTAAGTCCTGG -3’；

R1=SEQ ID NO 6=5’- CATGGTTCAAGTTCACATAGTCCAG -3’。

10.如权利要求3-9任一项所述的方法构建获得的Wilson 疾病模型小鼠。