[发明专利]靶向小鼠Atp7b基因的gRNA及构建Wilson疾病小鼠模型的方法

说明书

本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠Atp7b基因的gRNA及构建Wilson疾病小鼠模型的方法；本发明设计了特异性靶向Atp7b基因的三条ｇRNA，利用cas9蛋白将Atp7b基因的Exon2‑Exon20敲除，所敲区域序列为非3倍数，造成移码突变，且敲除区域包含该基因编码区的91.91%，从而达到将该基因敲除的目的；使用CRISPR/Cas9系统构建Atp7b基因敲除小鼠模型方法简单易行，周期短，拿到阳性小鼠的概率高，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并为进一步开发针对该疾病的治疗方式提供服务。

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠Atp7b基因的gRNA及构建Wilson疾病小鼠模型的方法。

背景技术

威尔逊病(Wilson’s disease，WD)又称肝豆状核变性，是罕见的常染色体隐形遗传铜代谢疾病，本病属于风湿性疾病当中的混合性结缔组织病，临床上以肝病、神经症状为主要特征。组织中铜的蓄积增加是引起肝病、神经学病变、角膜周围出现棕绿色环(凯-弗环)、肾和其他器官发病的主要原因，且组织损伤可引起肝硬化脑基底节双侧软化、变性。据美国国家糖尿病、消化和肾病疾病研究所估计，全球约1/10000～1/30000的人患有该疾病，我国目前尚缺乏大样本多中心的威尔逊WD疾病发病率调查，但有文献分析该病在中国的发病率比西方国家高。

WD的发病机制在于ATP7B基因变异，ATP7B基因是位于细胞高尔基体膜上的铜转运ATP酶，主要在肝细胞上表达，正常人体中约90％铜离子由ATP7B介导经胆汁排出。正常情况下通过饮食摄入的铜经过肠道上皮细胞吸收后通过门静脉血转运到肝细胞的肝窦面，经过铜转运体1(CTR1)转运至肝细胞，在肝细胞内，铜离子与多个分子伴侣结合并转运到相应蛋白上发挥作用，铜离子可经抗氧化蛋白1(Atox1)转运，将其转运到高尔基体上的ATP7B分子，而后与铜蓝蛋白结合进而分泌道血液中发挥作用。当ATP7B基因发生变异导致ATP7B功能受到不同程度的损伤，铜蓝蛋白结合转运铜离子的能力也会不同程度的下降或完全消失。铜离子不能有效经过胆汁排泌导致其在肝细胞内蓄积，通过氧化应激损伤等方式损伤线粒体等细胞器，进而引起肝细胞脂肪变性、坏死与凋亡。肝细胞破坏后游离铜离子会释放到血液中引起机体其他损伤。为了研究该疾病的发病机制以及开发有效的治疗方法，构建该疾病的实验模型对于疾病的研究不可或缺，小鼠模型是目前公认到的制备人类疾病模型及研究基因组功能最有效的疾病模型，但是目前还缺乏高效的构建Wilson疾病小鼠模型的方法。

发明内容

针对现有技术不足，本发明利用CRISPR/Cas9技术快速在小鼠体内将Atp7b 基因敲除，构建WD疾病模型。CRISPR/Cas9是一种由gRNA指导，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物会引导Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，通过人工设计crRNA和tracrRNA两种RNA，改造成具有引导作用的gRNA，从而引导Cas9蛋白对DNA的定点切割，并产生一个平末端的双链DNA缺口，进而启动DNA损伤修复机制，主要通过非同源末端连接(Non-homologous endjoining， NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)的方式将断裂上下游两端的序列连接起来。Cas9蛋白若要发挥作用需要靶位点下游的一个5’-NGG-3’基序，即PAM序列，基因特异的gRNA模板序列为位于PAM序列前，同时gRNA序列避免4个以上的T结尾，GC含量最佳为30％～70％。另外在选择gRNA时应考虑到其脱靶效应，全基因的脱靶效应需考虑脱靶位点的碱基错配数尽量不超过5个，基于多方面考虑，我们共设计了三条针对Atp7b基因的gRNA，分别靶向Exon2 的5’端和Exon20的3’端。

本发明包括以下技术方案：

一组靶向小鼠Atp7b基因的gRNA，包括三条gRNA，其核酸序列分别为：