[发明专利]一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法

权利要求书

1.一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、预冻

将含有冻干保护剂的菌液平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-40℃，预冻温度-40℃，维持2～20h；

S2、升华干燥

S2.1、一阶升华

所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至-20℃～-50℃，并维持2～20h；

S2.2、二阶升华

所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至0或10℃，并维持1～3h；

S3、解析干燥

所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～100pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至10～35℃，并维持2～20h，制得CRM197菌种冻干粉；

所述菌液细菌浓度为1×10⁶cfu/mL～5×10⁹cfu/mL，

菌种来自美国典型培养物保藏中心，菌株编号为ATCC39255或ATCC39526或ATCC11049或ATCC51926或ATCC51280。

2.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，预冻条件为：冷阱温度≤ -80℃，预冻温度-70℃，真空度0pa，维持4h。

3.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，一阶升华条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度20pa，升温速率0.15℃/min，升温至-40℃，并维持12h。

4.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，二阶升华条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度10pa，升温速率0.2℃/min，升温至0℃，并维持2h。

5.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，解析干燥条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度1pa，升温速率0.5℃/min，升温至28℃，并维持8h。

6.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，所述菌液细菌浓度为5.0×10⁷cfu/mL。

7.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，每100ml所述冻干保护剂中包括有5～50g海藻糖。

8.根据权利要求7所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，所述冻干保护剂的制备方法为：将海藻糖使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml。

9.根据权利要求8所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，所述注射用水的温度为50℃～60℃。

10.根据权利要求7所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，定容后经0.22μm滤膜除菌过滤，得到菌种冻干保护剂。