[发明专利]一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法

说明书

本申请涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法，包括以下步骤：S1、将含有冻干保护剂的菌液平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上；S2、升华干燥；S2.1、一阶升华，冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上；S2.2、二阶升华，冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上；S3、解析干燥，冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，制得CRM197菌种冻干粉；本申请具有提高CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度的效果。

技术领域

本申请涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法。

背景技术

CRM197是一种将52位的甘氨酸替换为谷氨酸的单一突变的无毒性的白喉毒素突变体(文献1，2)，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，从而不能对细胞产生毒性作用，但在抗原性和免疫原性上仍和天然白喉毒素保持一致。CRM197是一种研究明确的蛋白质，作为多糖和半抗原的载体使其具有免疫原性。它被用作一种载体蛋白，用于许多已经被批准的疫苗，比如脑膜炎球菌、乙型流感嗜血杆菌和肺炎球菌感染的结合疫苗。

基于CRM197蛋白的多种优点，越来越多的企业利用发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种冻干粉为原料生产生物制品。

但是，目前CRM197蛋白菌种冻干粉的冻干后细菌浓度较低。因此，提高CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了提高CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度，本申请提供一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法。

本申请提供的一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法，采用如下的技术方案：

一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、预冻

将含有冻干保护剂的菌液平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-40℃，预冻温度-40℃，维持2～20h；

S2、升华干燥

S2.1、一阶升华

所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至-20℃～-50℃，并维持2～20h；

S2.2、二阶升华

所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至-10～-20℃，并维持1～3h；

S3、解析干燥

所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～100pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至10～35℃，并维持2～20h，制得CRM197菌种冻干粉；

所述菌液细菌浓度为1×10⁶cfu/mL～5×10⁹cfu/mL。

通过采用上述技术方案，本申请的冻干工艺设计合理，冻干曲线简便、耗时短，冻干后的菌种经复苏活性较高。冻干储存方法同时适用于主种子库和工作种子库。另外，控制菌液细菌浓度为1×10⁶cfu/mL-5×10⁹cfu/mL，可大大提升CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度以及冻干存活率。

优选的，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，预冻温度-70℃，真空度0pa，维持4h。