[发明专利]一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法

说明书

本发明涉及一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法。所述方法包括在猪基因组内的开放性位点Rosa26和安全性位点Hipp11进行基因修饰，所述基因修饰包括将rtTA表达盒敲入Rosa26位点，将TRE3G启动的报告基因表达盒敲入Hipp11位点。本发明通过在猪细胞水平实现双位点定点敲入Tet‑on系统同时引入phiC31/att系统，进一步通过SCNT获得Dox诱导外源基因表达猪模型，利用该猪模型，在细胞、胚胎和体内水平实验验证结果表明此双位点定点敲入Tet‑on系统能高效稳定的实现Dox调控外源基因的表达与关闭，未检测到不受调控的表达泄漏。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法。

背景技术

基因编辑猪是指人为的对猪基因组特定位点的DNA序列进行某种突变获得的基因修饰猪，并且这种基因突变可以稳定的遗传给后代，从而建立起有特定表型的基因修饰猪种群。

由于技术限制，最开始研究人员无法进行精确的基因工程改造，最早发展出来的基因修饰技术是随机转基因技术，1981年研究人员将HSV-TK质粒载体通过显微注射到小鼠受精卵内，然后移植到代孕母鼠体内，最后成功构建了携带外源基因的转基因小鼠，此研究首次证实利用原核显微注射技术(PNI)可构建转基因动物(参见：Ralph L.Brinster,HowardY.Chen,Myrna Trumbauer,et al.Somatic expression of herpes thymidinekinase in mice following injection ofa fusion gene into eggs[J].Cell,1981.)，首次证实利用原核显微注射技术(PNI)可构建转基因动物，随后研究人员利用原核显微注射技术成功制备了转基因兔，羊和猪等其他转基因动物。

近年来，新型高效基因编辑技术人工核酸酶的出现，使基因编辑猪的培育发生了革命性的变化。人工核酸酶是指可识别基因组内特定位点并对其切割的人为改造后的核酸内切酶，在基因组内特定位点引入双链断裂缺口，可以高效产生基于非同源重组的基因敲除，并能大大提高基于同源重组修复方式的基因敲入动物的制备效率，目前已发展出三代人工核酸酶，包括锌指人工核酸酶(ZFN)第一代人工核酸酶、TALEN第二代人工核酸酶和CRISPR/Cas9第三代人工核酸酶。不同于ZFN和TALEN通过蛋白质对特定DNA序进行识别与结合，CRISPR/Cas9是通过向导RNA对特定DNA序列进行识别与结合，利用Cas9核酸酶进行切割DNA序列，Hai等(2014)将Cas9 mRNA和gRNA注入猪受精卵获得了vWF基因敲除猪，制备了血管性血友病基因编辑猪模型。

基因的突变会带来不同表型，有些基因在动物发育过程中过表达或缺失是致死的，还有些基因只在特定发育阶段、特定的组织或器官中表达，传统的基因编辑动物模型无法满足研究此现象的特定要求，因此需要建立条件性基因编辑动物模型，对基因的表达进行时空调控，但由于昂贵的成本、较长的时间周期以及较高技术难度等方面的限制，条件性基因编辑猪模型的报导相对较少。