[发明专利]一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法

权利要求书

1.一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、诱导准备阶段：将iPSC消化为单细胞悬液，并加入外周神经元分化培养基P终止消化，将重铺诱导当天记为D0’，随后D2’天开始每天完全更换新鲜的外周神经元分化培养基P，并观察hiPSC的形态，培养6-8天。

步骤二、诱导成熟阶段：重铺成熟当天记为D0，更换步骤一培养瓶中的外周神经元分化培养基P为外周神经元成熟培养基N1或外周神经成熟培养基N2，培养至D10。

2.如权利要求1所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，

其特征在于，步骤一中诱导分化的步骤包括：

S1.1：将聚合度70-90％的干细胞消化为单细胞悬液，加入等体积的外周神经元分化培养基P终止消化；

S1.2：将细胞以每1cm²含0.1-5×10⁴个细胞的密度接种于预先用Matrigel胶包被过的培养瓶中，摇晃使细胞均匀分布后放入培养箱中，将重铺诱导当天记为D0’；

S1.3：D2’天完全更换新鲜的外周神经元分化培养基P，并观察hiPSC的形态，每天更换外周神经元分化培养基P至D8’或D10’。

3.如权利要求1所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，

其特征在于，步骤二中所述更换培养基的步骤包括，

S2.1：外周神经元进入成熟阶段，将细胞消化后以每1cm²含(0.5～5)×10⁴个细胞的密度接种于预先用Matrigel胶包被过的板中，更换培养瓶中外周神经元分化培养基P为外周神经元成熟培养基N1，重铺成熟当天新计为D0；

S2.2：D2与D3更换50％的外周神经元成熟培养基N1；

S2:3：D4开始更换75％的外周神经成熟培养基N2,D5开始每隔两天更换2/3的外周神经成熟培养基N2，培养至D10，即可得到分化的外周神经元细胞。

4.如权利要求1所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，

其特征在于，所述外周神经元分化培养基P是在基础培养中添加0.01-25uM的BMP信号抑制剂、0.5-50uM的ALK5抑制剂、0.02-50uM的GSK-3α/β抑制剂、0.01-50uM的γsecretase抑制剂和0-80uM的VEGF、FGF、PDGF抑制剂。

5.如权利要求4所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，其特征在于其中，所述BMP信号抑制剂是LDN212854、LDN193189中一种或者两种的组合。

6.如权利要求4所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，其特征在于其中，所述ALK5抑制剂是SB431542、SB505124D中一种或者两种的组合。

7.如权利要求4所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，其特征在于，所述GSK-3α/β抑制剂是CHIR-98014、SB415286、LY2090314或CHIR99021中一种或者两种以上的组合物。

8.如权利要求4所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，其特征在于，所述γsecretase抑制剂是RO4929097、NAPT或LY411575中一种或两种以上的组合物。

9.如权利要求4所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，其特征在于，所述VEGF，FGF，PDGF抑制剂是SU5402、E3810中一种或者两种的组合。

10.如权利要求4所述的一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，其特征在于，所述基础培养为在DMEM/F-12培养基、Neurobasal培养基中的一种或两种组合物中添加NEAA、B27、丙酮酸钠、CDLC、GlutaMAX

和视黄酸。