[发明专利]一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法

说明书

本发明公开一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，属于神经科学干细胞领域，包括诱导准备阶段与诱导成熟阶段，从而实现诱导多能干细胞体外分化为神经元。该方法诱导时间短，纯度高。并且该方法可用干细胞移植替代临床治疗神经退行性疾病，如用于帕金森病、脊髓损伤和胶质细胞相关疾病等的治疗，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及神经科学干细胞领域，具体而言，涉及一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法。

背景技术

诱导外周神经是指脑和脊髓以外的所有神经，包括神经节、神经干、神经丛及神经终末装置；外周神经系统药物包括胆碱类药物、肾上腺素受体激动剂、组胺受体拮抗剂、局部麻醉药等，此类药物的药效和毒性可通过外周神经元的体外细胞模型进行研究。此外，许多药物会引起外周神经系统功能病变，亟需合适的体外细胞毒性模型进行研究测试。目前药物诱导的神经毒性主要是用啮齿类动物体外模型进行研究，然而这种模型具有一定的局限性，啮齿类动物试验结果外推至人的可靠性有限，因此充足的人源性外周神经元模型对于评价药物外周神经毒性具有十分重要的意义。

人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)技术是近些年的研究热点。hiPSC规避了使用人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)所带来的伦理道德问题，可在体外大规模产生多种人源性的细胞类型。在神经科学领域，目前的研究表明hiPSC可成功分化获得多巴胺神经元、运动神经元和胶质细胞等，并有望作为补充和替代缺损的神经元，通过临床移植进一步用于帕金森病、脊髓损伤和胶质细胞相关疾病等的治疗，为患者带来新的希望。

虽然目前已可通过多种方法将hiPSC成功分化为外周神经元，但早期主要采用基质细胞共培养法进行，基质细胞大多选择PA6细胞等，由于基质细胞的存在使得培养条件不清楚，诱导时间较长且分化效率低。此外，研究人员一直致力于优化小分子抑制剂的组合，以期得到诱导时间短且分化效率高的外周神经元，但采用这些方法分化得到的外周神经元的纯度仍需进一步提高，并且对起始iPSC状态要求高，依赖于饲养层共培养细胞，存在不确定性培养因子(如血清、条件培养基等。

因此，一种能够高效分化iPSC的方法是本领域的研发方向。

发明内容

本发明目的在于提供将人诱导性多能干细胞高效分化为外周神经元细胞，本方案通过采用一种从人诱导多能干细胞分化为外周神经元的方法，包括如下步骤：

步骤一、诱导准备阶段：将iPSC消化为单细胞悬液，并加入外周神经元分化培养基P终止消化，将重铺诱导当天记为D0’，随后D2’天开始每天完全更换新鲜的外周神经元分化培养基P，并观察hiPSC的形态，培养6-8天。

步骤二、诱导成熟阶段：重铺成熟当天记为D0，更换步骤一培养瓶中的外周神经元分化培养基P为外周神经元成熟培养基N1或外周神经成熟培养基N2，培养至D10。

其中诱导成熟阶段中重铺成熟当天记的D0，是在诱导准备阶段的D8’或D10’后的重新计时。

诱导分化的步骤包括：

一：将聚合度70-90％的干细胞消化为单细胞悬液，加入等体积的外周神经元分化培养基P终止消化；

二：将细胞以每1cm²含0.1-5×10⁴个细胞的密度接种于预先用Matrigel胶包被过的培养瓶中，摇晃使细胞均匀分布后放入培养箱中，将重铺诱导当天记为D0’；

三：D2’天完全更换新鲜的外周神经元分化培养基P，并观察hiPSC的形态，每天更换外周神经元分化培养基P至D8’或D10’。

步骤二中所述更换培养基的步骤包括，