[发明专利]一种基因表达盒、重组表达载体及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基因表达盒、重组表达载体及其制备方法与应用。本发明提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、egfp阅读框、2A肽的编码序列和多位点人工接头序列。与现有技术相比，本发明中的载体含有大豆内源启动子驱动的GFP‑2A表达盒，以GFP作为标记基因进行阳性转基因根的筛选是一种可视化的筛选方式，规避了嵌合体植株对除草剂敏感的缺陷，既可进行转基因根筛选，还可保证筛选到根的阳性率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基因表达盒、重组表达载体及其制备方法与应用。

背景技术

反向遗传学是研究基因表型的重要方法之一，将目的基因进行过量的表达，能够鉴定基因的表型。常见的反向遗传学手段是转基因，获得大豆的T1代转基因植株需要5到8个月的时间，实验周期很长。根中基因的表达差异会影响根系发育和抗性，在根系生物学的研究中，研究学者们往往只关注根部的表型，而非整株。探索快速且特异性产生转基因大豆根的方法，能缩减实验周期。

有研究指出，发根农杆菌K599可以诱导大豆产生毛状根，此后的研究证实，将质粒导入K599后，可以诱导高于正常表达水平的目的基因的毛状根再生。但是由于毛状根和正常的不定根形态高度相似，如何区分转基因根和大豆的不定根，成为新的难题。在转基因植株的实验中，可以使用抗除草剂基因筛选转基因植株，但因Basta等除草剂会经蒸腾作用在植物体内传导，从而对地上部分植株具有致死性，因此不适用于毛状根筛选。

利用绿色荧光蛋白(GFP)是解决此问题的一种思路。GFP结构稳定，在植物中表达可以观测到绿色荧光。在细胞生物学、发育生物学和神经科学的研究中荧光蛋白得到了广泛的应用。

因此，如何同时利用荧光蛋白技术和目的基因筛选技术，仅通过观测荧光就可以挑选表达目的基因的毛状根，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组表达载体及其制备方法与应用，本发明综合使用2A肽、大豆内源启动子和荧光蛋白标签构建了重组表达载体，并获得了同时表达两个基因的大豆毛状根。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基因表达盒，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、egfp阅读框、2A肽的编码序列和多位点人工接头序列。

优选的，所述2A肽为F2A肽、T2A肽、P2A肽和E2A肽中的一种；所述多位点人工接头序列的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。

进一步优选为F2A肽，其核苷酸序列如SEQ NO：2所示。

优选的，所述启动子为Gmubi或GmubiXL。

进一步优选为Gmubi，其核苷酸序列如SEQ NO：3所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，包括所述的基因表达盒和初始载体。

优选的，所述初始载体为pCAMBIA1303、pBI121或pPZP100。

进一步优选为pCAMBIA1303。

本发明还提供了所述重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)当初始载体为pCAMBIA1303时，在初始载体的CaMV poly(A)signal和NOS终止子之间插入启动子，得到Vector-P；

(2)在步骤(1)得到的Vector-P的启动子和NOS终止子之间插入egfp阅读框，得到Vector-P-E；

(3)在步骤(2)得到的Vector-P-E的egfp阅读框和NOS终止子之间插入2A肽的编码序列，得到Vector-P-E-2A；