[发明专利]产缬氨酸的重组微生物及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及产缬氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。本发明的重组微生物与出发菌株相比，所述重组微生物中基因brnFE的启动子突变为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子，和/或，所述重组微生物中基因brnQ编码的内运蛋白产生突变形成突变体，所述突变体含有以出发菌株野生型基因brnQ编码的内运蛋白的氨基酸序列为参考序列，第112位的丙氨酸被苏氨酸或丝氨酸或酪氨酸取代的突变。本发明重组微生物为L‑缬氨酸高产菌株，能有效积累L‑缬氨酸，提高L‑缬氨酸的产量，为L‑缬氨酸的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及产缬氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C₅H₁₁NO₂，相对分子质量为117.15。L-缬氨酸呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇、乙醚、丙酮。L-缬氨酸等电点为5.96，熔点315℃。

L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-缬氨酸可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。医药工业中，L-缬氨酸可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。食品工业中，L-缬氨酸可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸也可用作氨基酸功能量饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。

目前L-缬氨酸的生产方法有三种：提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。但目前L-缬氨酸的菌种的发酵性能仍较差、L-缬氨酸的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种可实现缬氨酸高产的突变体、棒杆菌及其构建方法与应用。

具体地，本发明提供以下技术方案：

一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，所述重组微生物中基因brnFE的启动子突变为如SEQ ID NO.1所示的DNA分子，和/或，所述重组微生物中基因brnQ编码的内运蛋白产生突变形成突变体，所述突变体含有以出发菌株野生型基因brnQ编码的内运蛋白的氨基酸序列为参考序列，第112位的丙氨酸被苏氨酸或丝氨酸或酪氨酸取代的突变。

本发明通过1.对brnQ基因进行点突变，使得第112位氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸或酪氨酸Tyr，具体的密码子由GCG突变为GCA或GCT或TAC。从而弱化了缬氨酸内运系统的通路，有助于增加缬氨酸的产量，避免缬氨酸被菌株再次利用；和/或，2.在支链氨基酸外运蛋白的基因brnFE的启动子区引入特定点突变，从而提高了缬氨酸的外排效率，从而最终获得高产L-缬氨酸的基因工程菌。

本发明中，所述突变体具有如SEQ ID NO.2-4中任一所示的氨基酸序列。

所述出发菌株为棒杆菌属细菌或短杆菌属细菌；

优选地，所述棒杆菌属细菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)；所述短杆菌属细菌为黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)；

更优选地，所述出发菌株为能够积累缬氨酸的棒杆菌属细菌。