[发明专利]一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法

权利要求书

1.一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，包括步骤一，DNA提取；步骤二，PCR扩增；步骤三，电化学免疫传感器检测；其特征在于：

其中上述步骤一中，首先对样品进行预处理，然后取适量样品，加入裂解缓冲液，使样品在55～65℃的环境下静置1.5～2.5h进行裂解分离，然后取裂解分离后的上清液，用混合有机溶剂抽提出DNA，得到含DNA的抽提液；然后加入2～4M浓度的醋酸钠和1～2倍体积的无水乙醇充分混匀后于-10～-30℃下静置0.5～1h，进行析出处理；然后将析出的DNA沉淀，并在室温下干燥；然后向沉淀中加pH6～7的Tris-HCl缓冲液和硫氰酸胍至沉淀完全溶解，然后加入二氧化硅微珠悬浮液，摇匀；然后用70％乙醇洗涤硅珠沉淀；然后脱去硅珠中残存的乙醇后加入TE液洗脱，离心分离得到含DNA的TE液；然后将获得的含有DNA的TE溶液通过DNA试剂盒提取，得到沉淀物的DNA；

其中上述步骤二中，首先向27μL的PCR反应混合物中加入2μL沉淀物的DNA、1μL的正向引物、1μL的反向引物和19μL的双蒸水，得到50μL的PCR扩增反应体系；然后在94℃的条件下预变性3min；之后在94℃的条件下变性30s；然后在60℃条件下退火30s；然后在72℃条件下延伸20s；最后在45个循环后，在72℃条件下延伸7min，制成PCR扩增产物；

其中上述步骤三中，以金电极作为工作电极，甘汞作为参比电极、铂作为对比电极，取步骤二中制得的PCR扩增产物，滴到电化学免疫传感器的金工作电极表面，30℃下反应2h后，冲洗晾干，将处理后的金工作电极、甘汞参比电极和铂对比电极连接到电化学工作站，制成电化学免疫传感器，然后将工作电极浸入催化反应溶液中，记录该电化学免疫传感器的电流响应，最后绘制电流曲线。

2.根据权利要求1所述的一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，其特征在于：所述步骤一中，预处理为用磷酸盐缓冲液或0.9％的生理盐水浸泡、洗涤样品。

3.根据权利要求1所述的一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，其特征在于：所述步骤一中，裂解缓冲液由Tris-HCl、EDTA和十六烷基三甲基溴化铵配制而成。

4.根据权利要求1所述的一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，其特征在于：所述步骤一中，混合有机溶剂为酚、氯仿和异戊醇按25：24：1的体积比混合制成。

5.根据权利要求1所述的一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，其特征在于：所述步骤二中，制成PCR扩增产物后，将PCR扩增产物置于4℃环境下保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，其特征在于：所述步骤三中，催化反应溶液为0.1MKCl的10mMTris-HCl缓冲液，以-0.3V电压为工作电压。