[发明专利]一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法

说明书

本发明公开了一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，包括步骤一，DNA提取；步骤二，PCR扩增；步骤三，电化学免疫传感器检测；其中上述步骤一中，首先对样品进行预处理，然后取适量样品，加入裂解缓冲液，使样品在55～65℃的环境下静置1.5～2.5h进行裂解分离，然后取裂解分离后的上清液，用混合有机溶剂抽提出DNA，得到含DNA的抽提液；该发明采用电化学免疫传感器对PCR扩增产物进行检测，通过电化学免疫传感器的电流响应绘制电流曲线，通过电流曲线的变化，实现对DNA甲基化特异性检测的目的，该检测方式较为简单、全面，所需样本较少，且该电化学免疫传感器可重复使用，便于重复检测，降低了成本，便于推广使用。

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，具体为一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法。

背景技术

DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，甲基化水平的检测对于研究宿主的特定基因表达情况具有重要意义，而对于人类而言，DNA甲基化与癌症关系巨大，因对于DNA甲基化特异性检测方法有了一定的要求；但是，现有的DNA甲基化特异性检测方法大多采用荧光法或溶解曲线分析法进行检测，使用荧光法检测DNA甲基化特异性时，成本较高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响，检测方式较为复杂；使用溶解曲线分析法检测DNA甲基化特异性时，虽然操作简单，但同样需要较高的成本，需使用带有HRM模块的荧光定量PCR仪。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，以解决上述背景技术中提出成本较高以及检测方式较为复杂的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种电化学免疫用DNA甲基化特异性检测方法，包括步骤一，DNA提取；步骤二，PCR扩增；步骤三，电化学免疫传感器检测；

其中上述步骤一中，首先对样品进行预处理，然后取适量样品，加入裂解缓冲液，使样品在55～65℃的环境下静置1.5～2.5h进行裂解分离，然后取裂解分离后的上清液，用混合有机溶剂抽提出DNA，得到含DNA的抽提液；然后加入2～4M浓度的醋酸钠和1～2倍体积的无水乙醇充分混匀后于-10～-30℃下静置0.5～1h，进行析出处理；然后将析出的DNA沉淀，并在室温下干燥；然后向沉淀中加pH6～7的Tris-HCl缓冲液和硫氰酸胍至沉淀完全溶解，然后加入二氧化硅微珠悬浮液，摇匀；然后用70％乙醇洗涤硅珠沉淀；然后脱去硅珠中残存的乙醇后加入TE液洗脱，离心分离得到含DNA的TE液；然后将获得的含有DNA的TE溶液通过DNA试剂盒提取，得到沉淀物的DNA；

其中上述步骤二中，首先向27μL的PCR反应混合物中加入2μL沉淀物的DNA、1μL的正向引物、1μL的反向引物和19μL的双蒸水，得到50μL的PCR扩增反应体系；然后在94℃的条件下预变性3min；之后在94℃的条件下变性30s；然后在60℃条件下退火30s；然后在72℃条件下延伸20s；最后在45个循环后，在72℃条件下延伸7min，制成PCR扩增产物；

其中上述步骤三中，以金电极作为工作电极，甘汞作为参比电极、铂作为对比电极，取步骤二中制得的PCR扩增产物，滴到电化学免疫传感器的金工作电极表面，30℃下反应2h后，冲洗晾干，将处理后的金工作电极、甘汞参比电极和铂对比电极连接到电化学工作站，制成电化学免疫传感器，然后将工作电极浸入催化反应溶液中，记录该电化学免疫传感器的电流响应，最后绘制电流曲线。

优选的，所述步骤一中，预处理为用磷酸盐缓冲液或0.9％的生理盐水浸泡、洗涤样品。

优选的，所述步骤一中，裂解缓冲液由Tris-HCl、EDTA和十六烷基三甲基溴化铵配制而成。

优选的，所述步骤一中，混合有机溶剂为酚、氯仿和异戊醇按25：24：1的体积比混合制成。

优选的，所述步骤二中，制成PCR扩增产物后，将PCR扩增产物置于4℃环境下保存备用。