[发明专利](2S,3S)-2-氯-3-羟基酯类化合物的制备方法

权利要求书

1.一种(2S,3S)-2-氯-3-羟基酯类化合物的制备方法，采用来源于发酵乳酸杆菌的羰基还原酶催化不对称还原2-氯-β-酮酯类化合物生成化合物(2S,3S)-2-氯-3-羟基酯类化合物（I）；所述2-氯-β-酮酯类化合物的结构式为（II）所示：

式中R¹为氟、氯、溴、碘等卤素，C1-C8烷基或环烷基，噻吩基，呋喃基，萘基、吡啶基等；R²为C1-C8烷基或环烷基、单取代或多取代芳基；

制备的具体步骤为：

（1）制备含羰基还原酶的第一工程菌和含葡萄糖脱氢酶的第二工程菌；

（2）分别制备两种工程菌的静息细胞悬浊液；

（3）分别制备含羰基还原酶的细胞上清液和含葡萄糖脱氢酶的细胞上清液；

（4）将上述两种细胞上清液混合，然后再与化合物(II)、溶剂、氢供体和辅因子混合，进行不对称还原反应，制得化合物(I)；其反应式，如下：

其中，所述氢供体为葡萄糖，所述辅因子为NADP⁺/NADPH；所述羰基还原酶的对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述工程菌含有表达载体pET-28a-LfSDR1，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述制备两种工程菌的静息细胞悬浊液，具体步骤为：将第一工程菌或第二工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大培养至OD600值达到0.8-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液。

4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.05 mM-0.8 mM；加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为15-25 ℃，培养时间为8-24 h；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为30-300 mM。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述制备两种细胞上清液，具体步骤为：对所述第一静息细胞悬浊液或所述第二静息细胞悬浊液进行超声破碎，离心，获得所述第一细胞上清液或所述第二细胞上清液。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述两种细胞上清液的混合液中，第一细胞上清液和第二细胞上清液的体积比为20:1-1:2。

7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）的不对称氧化还原反应中，所述化合物（II）的浓度为1.0-300 g/L，所述第一静息细胞悬浊液的细胞浓度为0.1 g湿重/L-25 g湿重/L，所述第二静息细胞悬浊液的细胞浓度为0.1 g湿重/L-25 g湿重/L，所述氢供体的浓度为5-750 g/L，所述辅因子的浓度为0-0.5 mM。

8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）的不对称氧化还原反应中，反应温度为20-40 ℃，反应缓冲液pH为6.0-9.0；缓冲浓度为100-250 mM。

9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）的不对称还原反应中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液与助溶剂的混合溶剂；其中，助溶剂选自高介电常数溶剂、芳香族溶剂、非极性溶剂、极性溶剂；所述高介电常数溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺，所述芳香族溶剂为苯、甲苯、乙苯、氯苯或溴苯，所述非极性溶剂为正己烷或环己烷，所述极性溶剂为乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、1, 2-二氯乙烷、甲醇、乙醇或异丙醇。

10.如权利要求1-9之一所述的制备方法，其特征在于，在整个反应过程中，待反应至GC检测底物完全耗尽后，用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠洗涤2次，水洗1次，饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标产物。