[发明专利]同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因位点多种突变的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因位点多种突变的引物组、试剂盒和方法。其中所述试剂盒包括以下试剂：（1）用于多重PCR扩增的试剂；和（2）用于构建三代测序文库的试剂。其中所述方法包括以下步骤：（1）制备受试者样本；（2）多重PCR同时扩增所述样本中HBA1/2、HBB和HBD基因片段；（3）构建三代测序文库；（4）测序并分析HBA1/2、HBB和HBD基因突变类型。

技术领域

本发明涉及一种利用三代长读长测序平台同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因多种突变的引物组合和方法，以及适用于此方法的试剂盒。

背景技术

α-珠蛋白或β-珠蛋白的合成缺失或不足会导致珠蛋白生成障碍性贫血，又称地中海贫血（简称地贫）。地贫主要分为α-地贫和β-地贫，是世界上最常见的单基因遗传病，属常染色体隐性遗传，高发地区包括中国南方、东南亚、地中海地区、印度、中东和非洲等地区^1,2,3。

人源α-珠蛋白基因簇位于16号染色体，共包含7个基因位点：5’-HBZ-HBZps-HBM-HBA1ps-HBA2(α1)-HBA1(α1)-HBQ-3’。其中只有HBA1和 HBA2两个基因在胚胎和成年人中都具有编码珠蛋白的能力。HBA1和HBA2基因的突变包括缺失型突变和非缺失型突变。我国最常见的缺失型HBA1和HBA2基因的突变为-α3.7，-α4.2，和--SEA，非缺失型突变为HBA2:c.369CG，HBA2: c.377TC，HBA2: c.427TC。这六种基因突变占中国人群α-地贫总数的98%，因此现有的临床常规分子诊断主要针对上述突变^3,4,5。随着α-地贫致病机制的不断阐明，越来越多的突变类型被发现。综合Ithanet，HbVar，LOVD和LOVD-China地贫数据库，目前在世界范围已经发现约50种α-珠蛋白基因簇区域的缺失，和超过900种HBA1和HBA2基因的非缺失型突变可导致α-珠蛋白表达的减低或缺失。除此之外还有些罕见的结构变异，如αααanti3.7，αααanti4.2，HKαα和antiHKαα等。传统的Gap-PCR方法难以检测罕见的结构变异，且无法区分HKαα和-α3.7，也无法区分antiHKαα和-α4.2，在筛选时会导致误诊⁶。而准确区分这些基因型需要借助不同的PCR体系，无法在同一体系内实现同时检测。这些说明α-地贫有较广的基因突变谱，增加目前α-地贫基因缺陷的筛查范围，将会有效避免异常基因型的漏检。