[发明专利]一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法

权利要求书

1.一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤

A真菌蛋白的提取；

B对所述真菌蛋白液进行纯化与酶解；

C对酶解后的所述真菌蛋白液进行UPLC-MS-MS分析，按质谱-色谱条件下的方法记录质谱指纹图谱；

D对所述质谱指纹图谱进行方法学考察，验证所建立质谱指纹图谱方法的可行性，为下一步寻找冬虫夏草及各发酵虫草制剂的特征离子进而鉴别真伪提供大数据支持。

2.根据权利要求1所述一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述真菌蛋白的提取的方法包括：取样品粉末约10mg，加入适量去离子水涡旋混匀后，离心，弃去上清液，按试剂盒法提取真菌蛋白。提取2次，合并上清液，混匀后离心，吸取上清液测定蛋白的浓度，上清液全部置于内衬离心管中，离心，弃去滤液，离心管中加0.05M NH₄HCO₃溶液适量，洗涤2次，分别离心，弃去滤液，将内衬离心管倒置反超滤离心，滤液中加0.05MNH₄HCO₃溶液稀释至浓度为1mg/mL的溶液，混匀，待用。

3.根据权利要求1所述一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述蛋白提取液纯化与酶解的方法包括：将样品与上样Buffer混合，加热5min，放置室温，每孔上样20μL，100V通电10min将样品跑入16％聚丙烯酰胺分离胶中纯化，考马斯亮蓝染色，乙酸脱色，将蓝色条带切下并切成小块，超纯水清洗，加入10mM DTT没过胶块于56℃下反应，吸出液体，加入55mM碘乙酰胺液室温下避光反应。加入0.05M NH₄HCO₃/ACN(1:1)溶液脱色至胶块变为无色，吸取液体，真空干燥。按1:20(W/W)加入胰蛋白酶，放置使胶粒充分溶胀，加入0.05M NH₄HCO₃适量，37℃下酶解18h，加入50％ACN(含5％TFA)于胶粒中，37℃温育1h，0.1％甲酸溶解后离心取上清液进行UPLC-MS-MS分析。

4.根据权利要求1所述一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述色谱-质谱联用检测的色谱条件的流动相为：A：0.1％甲酸液；B：0.1％甲酸-乙腈液；流速：300nL/min。梯度洗脱程序如下：

5.根据权利要求1所述一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法，其特征在于，在色谱-质谱联用检测的质谱条件采用纳米电喷雾离子源(NSI)正离子监测模式，喷雾电压2.2kV，鞘气(N2)流速60arb(约400kPa)，扫描范围(m/z)为350～1550，一级质谱采用Orbitrap检测器，Orbitrap Resolution：120000，二级质谱扫描为DIA扫描，采用离子肼检测器，二级质谱碰撞能量为35％。

6.根据权利要求1所述一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法，其特征在于，对所述质谱指纹图谱进行方法学考察，包括(1)精密度考察：取百令胶囊内容物10mg，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法重复进样6次，记录质谱指纹图谱。因本实验建立指纹图谱的目的是寻找各样品的差异性特征肽成分，每个水解多肽的标识是保留时间和精确质量，故选取指纹图谱中保留时间有代表性的7个离子(330.1976，508.2743，615.3333，577.2941，218.2128，802.4413，246.2455)提取色谱峰，计算7个离子色谱峰的保留时间和精确质量，提取离子色谱图见图1，结果表明，各离子色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，符合指纹图谱技术要求。(2)重复性考察：取百令胶囊10mg，共6份，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法进样，记录质谱指纹图谱。同理选取上述7个离子提取色谱峰，计算7个离子色谱峰的保留时间和精确质量。结果表明，各色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，符合指纹图谱技术要求。(3)稳定性考察：取百令胶囊10mg，提取真菌蛋白液并进行纯化与酶解，按质谱-色谱条件下的方法分别于0，2，4，8，12，24小时测定，记录质谱指纹图谱。选取上述7个离子提取色谱峰，结果表明，7个离子色谱峰在24小时内均可检出，各色谱峰的保留时间和精确质量的RSD均小于1.0％，说明样品在24小时内较为稳定，符合指纹图谱定性鉴别的技术要求。