[发明专利]一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法

说明书

本发明公开了一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法，包括真菌蛋白的提取；对所述真菌蛋白液进行纯化与酶解；对酶解后的所述真菌蛋白液进行UPLC‑MS分析，按质谱‑色谱条件下的方法建立质谱指纹图谱，并进行方法学考察；所述质谱指纹图谱为进一步寻找冬虫夏草及各发酵虫草制剂的特征离子提供了大数据支持。本发明构建的方法具有操作简单、灵敏度高、准确性好等优点，能从质谱的整体特征上把握各样品真菌蛋白酶解肽的质量情况，为冬虫夏草及各发酵虫草菌粉和制剂的质量控制、真伪鉴别提供了新的科学方法。

技术领域

本发明属于中药成分鉴定技术领域，尤其涉及一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法。

背景技术

中药成分复杂，以某一成分作为控制指标已经不适合中药质量控制的要求。中药指纹图谱既可以评判中药材的真伪与优劣也可以判断中药成方制剂的质量优劣及制备工艺的合理性。与单一成分作为控制指标的质量控制方法相比，指纹图谱能够从整体化学成分上全面反映样品的质量，进而达到有效控制质量的目的，克服了中药有效成分大多不明确这一劣势。

化学计量学是一门将统计学、数学以及计算机技术的方法和原理结合应用来处理化学数据的学科，它可以对化学测量过程进行优化，并可以从所测量得到的化学数据中最大程度的提取对分析有用的化学信息，其最突出的特征是将多变量分析的方法引入到了化学研究的领域，这种思想是与中医用药的思想有相通之处的，因此，将化学计量学应用于中药的研究中是可行的。指纹图谱应用于中药质量控制中的研究是离不开化学计量学的。将现代仪器分析的方法与化学计量学方法合理结合利用，有效提取有用信息，对于改善并提高中药质量控制方法，推进中药现代化进程有深远的影响。

天然冬虫夏草与各发酵虫草菌粉中有相似的化学成分，如甾醇类、核苷类、虫草多糖类、蛋白质和氨基酸类、甘露醇、硬脂酸、软脂酸、维生素、有机酸及微量元素等。真菌蛋白作为有效成分之一，研究甚少。为考察冬虫夏草及这些发酵虫草菌粉及制剂的真菌蛋白特点和差异，我们在同样的条件下分析并建立了各样品中真菌蛋白酶解后所得多肽类成分的质谱指纹图谱，并进行了方法学考察，为后期考察各样品的整体质量及寻找能够鉴别冬虫夏草和不同发酵虫草菌粉及制剂的特征肽段，为各发酵虫草菌粉及制剂的质量控制建立了有效方法，同时为综合评价各发酵虫草菌粉及制剂的质量提供技术支持。基于上述分析，提出一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法。

发明内容

本发明提供一种真菌蛋白酶解肽指纹图谱的建立方法。

本发明包括以下步骤：

A真菌蛋白的提取；

B对所述真菌蛋白液进行纯化与酶解；

C对酶解后的所述真菌蛋白液进行UPLC-MS分析，按质谱-色谱条件下的方法记录质谱指纹图谱；

D对所述质谱指纹图谱进行方法学考察，验证所建立质谱指纹图谱方法的可行性，为下一步寻找冬虫夏草及各发酵虫草制剂的特征离子进而鉴别真伪提供大数据支持。

进一步地，所述真菌蛋白的提取的方法包括：取样品粉末约10mg，加入去离子水涡旋混匀后，离心，弃去上清液，按试剂盒法提取真菌蛋白。提取2次，合并上清液，混匀后离心，吸取上清液测定蛋白的浓度，上清液全部置于内衬离心管中，离心，弃去滤液，离心管中加0.05M NH₄HCO₃溶液适量，洗涤2次，分别离心，弃去滤液，将内衬离心管倒置反超滤离心，滤液中加0.05M NH₄HCO₃溶液稀释至浓度为1mg/mL的溶液，混匀，待用。