[发明专利]一种筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法

权利要求书

1.一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤一：利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD-GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA-GDH和pMD-GDH；

步骤二：将pPICZαA-GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33-GDH-2，将其制成感受态；

步骤三：将pMD-GDH电转入X33-GDH-2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。

2.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤一中重组质粒pMD-GDH、pPICZαA-GDH的构建具体方法为：目的基因FAD-GDH连接在pUC57T载体上，3’和5’两端分别有EcoRI和NotI限制性酶切位点，中科院微生物研究所提供的pMD-AOX质粒及pPICZαA质粒也存在这两个酶切位点，将pUC57-GDH和实验室保存的pMD-AOX质粒、pPICZαA分别进行EcoRI和NotI双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收GDH目的基因及pMD空载、pPICZαA空载，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体。用T4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功。

3.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤二中重组毕赤酵母产FAD-GDH的菌株构建的具体方法为：重组质粒pPICZαA-GDH采用SacI线性化后电转表达宿主Pichia pastoris X33，构建重组菌X33/pMD-GDH，电转条件：4Kv，4-5ms，快速加入1ml预冷的YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养2-4h，4000rpm离心5min，弃上清，用1ml过滤除菌的生理盐水洗3次，然后取500μL涂布在终浓度为100μg/mLZeocin的YPD平板上，30℃培养，2-3天后获得阳性转化子；

将阳性转化子挑取单菌落接种于盛有5mlYPCS(含终浓度100μg/mLZeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力；

试管发酵水平筛选获得毕赤酵母重组表达菌株X33-GDH-2，将其制成感受态。重组质粒pMD-GDH采用同样的方法电转入感受态菌株X33-GDH-2，然后取500μL涂布在G418终浓度为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml的YPD梯度平板上，30℃培养，3-6天后获得阳性转化子。

4.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，步骤三中高酶活重组毕赤酵母菌株的筛选具体方法为：将阳性转化子挑取单菌落接种于盛装5mlYPCS(含终浓度100μg/mLZeocin)的试管中，250rpm/min，30℃培养，16h-18h后加甲醇，使甲醇溶液的体积百分浓度为1％，之后24h和48h后均各加相同体积的甲醇诱导，96h培养后毕赤酵母菌经8000r/min离心5min收集上清，测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力。

具体方法如下：

DCIP反应体系包括终浓度50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.5，300μM DCIP和100mM葡萄糖。

具体如下：

1、反应体系3.1ml：底物葡萄糖2.9ml、9×10-3Mol/L DCIP 100μl、酶液100μl；

2、检测520nm处吸光值的变化(吸光值下降)；

3、计算公式：

酶活(U/ml)＝△A×3.1×稀释倍数D/6.9×0.1×3min。