[发明专利]一种筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法

说明书

本发明提供了一种筛选高表达FAD‑GDH的重组毕赤酵母菌株的方法。包括如下步骤：通过依次使用Zeocin、G418及G418浓度梯度筛选，以增加重组菌中FAD‑GDH基因拷贝数。首先，利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD‑GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA‑GDH和pMD‑GDH；然后，将pPICZαA‑GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33‑GDH‑2，将其制成感受态；最后将pMD‑GDH电转入X33‑GDH‑2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。结果表明，转入pMD‑GDH后100μg/mlG418平板上的转化子X33‑GDH‑2‑1酶活比X33‑GDH‑2提高94％；2000μg/mlG418梯度平板上菌株X33‑GDH‑2‑17酶活最高，比X33‑GDH‑2‑1提高97％。结果表明了依次使用不同筛选标记及浓度梯度策略有助于提高FAD‑GDH的表达量。

技术领域

本发明涉及酵母菌株筛选的技术领域,更具体的说是涉及一种筛选高表达FAD-GDH的重组毕赤酵母菌株的方法。

背景技术

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-dependent glucose dehydrogenase，简称FAD-GDH，EC 1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，简称GOD)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于GMC氧化还原酶(glucose-methanol-choline-oxidoreductase)家族。它是以FAD为辅基能够在NAD(P)+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而D-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。

在目前使用的血糖检测用酶中，葡萄糖氧化酶(GOD)因其能利用氧作为电子受体，样品中氧分压的改变会使检测结果产生误差，而GDH不利用氧作为电子受体，不会产生此种偏差，适用于检测包括静脉血、动脉血、高海拔等氧气含量不同的样本，近年来成为便携式血糖监测系统的研究热点。所以亟需实现FAD-GDH的高效表达。

目前，毕赤酵母P.pastoris已经成为外源表达蛋白的成熟宿主，P.pastoris正筛选标记主要分为抗生素标记和营养缺陷型筛选标记。其中，抗生素标记主要包括由Streptoalloteichus hindustanus中Sh ble基因赋予的博来霉素Zeocin抗性和来源于Tn903转座子的Kan基因赋予的遗传霉素G418抗性。

通常情况下，仅含单个拷贝外源基因的重组菌可能由于转录水平较低而表达量不高。为了提高外源基因在毕赤酵母中的表达水平，研究中通常采用的策略之一是筛选含多拷贝外源基因的重组菌株。然而，在缺乏较强筛选压力的情况下，外源载体转化毕赤酵母自然发生多次单交换重组整合的概率较低，以下两种方法常被用于提高构建多拷贝P.pastoris重组菌株的效率。

(1)高浓度抗生素直接筛选法：含抗生素标记基因的载体转化宿主后，直接使用含较高浓度的抗生素平板进行筛选。尽管可行，但使用该法获得的耐高浓度抗生素克隆子中仅有不足5％的多拷贝重组菌株，且所含外源基因拷贝数超过10的重组子仅约1-2％；可见，使用该方法筛选获得高拷贝重组菌的效率仍然较低。

(2)含不同筛选标记载体多次转化法：将目的基因插入多种含不同筛选标记的重组载体，并依次转化同一宿主实现重组菌中基因拷贝数的增加。Fan等将Thermomyceslanuginosus lipase基因分别克隆至使用His4营养缺陷型筛选和Zeocin抗生素筛选的表达载体，并将其依次转化P.pastoris而成功获得了含较高拷贝的重组菌株。该方法简单实用，但其所构重组菌株中外源基因的拷贝数往往受到毕赤酵母可用筛选标记数量的限制。

因此，在需要筛选含较高拷贝的重组菌时，需要采取或结合其它分子生物学方法。

发明内容