[发明专利]鉴定钩吻及易混淆品和待测样本是否掺入钩吻的方法

说明书

本发明涉及用于快速鉴别钩吻及其易混淆品的方法，其包括1)提取钩吻及其易混淆品植物或药材的样本中的DNA，获取样本中的全基因组DNA；2)以全基因组DNA为模板，通过HRM‑PCR扩增，获得包含完整内部转录间隔区2序列区域的扩增产物；3)对扩增过程中的HRM曲线进行分析，从而实现钩吻及其易混淆品的鉴别。上述方法具有免测序、快速、灵敏度高等优点。另外，类似地，本发明还涉及用于鉴定待测样本中是否掺入钩吻的方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及快速鉴定钩吻及其易混淆物的方法以及鉴定待测样本中是否掺入钩吻的方法。

背景技术

钩吻(Gelsemium elegans)为马钱科钩吻属常绿木质藤本植物，又名断肠草、烂肠草、大茶药等，主要分布于福建、广东、海南、广西、贵州、云南等地。钩吻主要作为地方性药材资源，具有祛风攻毒，消肿止痛的功效，用于治疗疥癞，湿疹，跌打损伤，风湿痹痛，神经痛等症。但该植物全株有毒，根、茎、枝、叶中均含有剧毒生物碱类成分，少量服用即可引起人体的中毒反应，甚至导致死亡，故又名“断肠草”，属于有毒蜜源之一，因食用含钩吻的蜂蜜中毒事件在我国南部了地区屡见不鲜。因此其药用时只作外用，不可内服。钩吻常见混淆品为金银花、粗叶榕、狼毒和白屈菜，金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica)的干燥花蕾，为大宗类药食兼用品；与钩吻花形态、颜色相似，并且二者花期均在夏、秋两季，极易发生误采误食事件；粗叶榕(Ficus hirta)，又名五指毛桃，其根具有益气健脾、祛痰化湿之效，是华南地区常用的药食同源类中药材，五指毛桃根与钩吻根常缠绕伴随共生，并且形态相近，故在采集时易发生误挖或相互混入的情况。近年来，已报道多起因将钩吻误作为金银花或五指毛桃服用而导致的中毒事件；狼毒(Stellera chamaejasme)及白屈菜(Chelidonium majus)为多年生草本植物，皆可做药用，但二者均有毒，并且皆被习称为“断肠草”，其相互之间的误采、误用也会对人体的生命健康安全造成威胁。

现有研究中，有利用DNA条形码技术通过特征核苷酸序列对钩吻及其易混淆品进行鉴别(王虹等，“钩吻属植物及其易混淆品五指毛桃的DNA条形码比较分析”，中国现代中药，2020年第12期)。钩吻毒性强，杨川梅等基于近红外光谱结合水光谱组学法对含有钩吻的毒蜂蜜进行鉴定，尚未见到利用高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting curve,HRM)快速鉴定钩吻及其易混淆品的相关报道。

因此，有必要建立一种钩吻及其易混淆品的快速鉴别方法，以保障人体的生命健康安全。

发明内容

本发明的一个目的在于提供快速鉴定钩吻及其易混淆物的方法；本发明的另一目的在于提供鉴定待测样本中是否掺入钩吻的方法。

特别地，一方面，本发明涉及一种用于快速鉴别钩吻及其易混淆品的方法，其包括以下步骤：

1)提取钩吻及其易混淆品的植物或药材的样本中的DNA，获取样本中的全基因组DNA；

2)以全基因组DNA为模板，通过HRM-PCR扩增，获得包含完整内部转录间隔区2(Internal Transcribed Spacer 2，ITS2)序列区域的扩增产物；

3)对扩增过程中的HRM曲线进行分析，从而实现钩吻及其易混淆品的鉴别。

根据本发明的一个优选实施方案，钩吻为马钱科钩吻原植物及其药材。

根据本发明的一个优选实施方案，易混淆品为忍冬、粗叶榕、狼毒及白屈菜的原植物及其药材。

根据本发明的一个优选实施方案，HRM-PCR扩增使用SEQ ID No.1:5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'的正向引物和SEQ ID No.2:5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'的反向引物。