[发明专利]快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR的引物和探针序列，其特征在于，包括以下禽腺病毒Hexon基因的特异性引物和探针，其序列如下：

上游引物序列为：5’-TTCGACACGTCCATCAACTG-3’；

下游引物序列为：5’-GTCGTAGTGGAAGTACTGACG-3’；

探针序列：5’-TGCGACATCACCAAGGACT-3’；

其中TaqMan探针序列的5’端采用FAM标记荧光报告基团，3’端采用MGB标记荧光淬灭基团。

2.一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR方法，其特征在于：包括FAdv-4和FAdv-8荧光定量PCR标准曲线的建立、FAdv-4和FAdv-8阳性病料的检测；

其中FAdv-4和FAdv-8荧光定量PCR标准曲线的建立包括标准曲线模板DNA的配制、荧光定量PCR反应及标准曲线的绘制。

3.根据权利要求2所述一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR方法，其特征在于：所述标准曲线模板DNA的配制步骤如下：在PCR小管中分别加入3μL重组质粒提取液和10μL TB稀释液，充分混匀，即稀释为提取液的1/10，依次按照10倍梯度稀释，获得溶液的浓度依次为重组质粒提取液的10^-1、10^-2、…10^-9；

所述荧光定量PCR反应剂标准曲线的绘制步骤如下：以上述步骤中的稀释后的重组质粒溶液为阳性DNA模板来配制荧光定量PCR反应体系；待反应结束后，调整矫正线后记录每个浓度对应的平均Ct值，即荧光信号到达设定阈值所需的循环数，绘制标准曲线；以Ct值为y轴，模板DNA中拷贝数的对数为x轴，拟合的标准曲线为y＝-3.477x+40.169，R²＝0.9991；根据标准曲线的斜率可以计算出引物的扩增效率为94％。

4.根据权利要求2所述一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan探针荧光定量PCR方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应体系成分与用量如下：

体系成分	用量
2-x-AceQ-qPCR-Probe-Master-Mix	10-uL
50-x-Rox-Reference-Dye	0.4-μL
上游引物(10-μM)	0.4-μL
下游引物(10-μM)	0.4-μL
探针(10-μM)	0.2-μL
DNA	1-μL
2O]]>	7.6-μL

。

5.根据权利要求2所述一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan探针荧光定量PCR方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应条件如下：