[发明专利]快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR方法

说明书

本发明提供了一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan引物和探针序列，包括以下目的基因的特异性引物和探针，其序列如下：上游引物序列为：5’‑TTCGACACGTCCATCAACTG‑3’；下游引物序列为：5’‑GTCGTAGTGGAAGTACTGACG‑3’；探针序列：5’‑TGCGACATCACCAAGGACT‑3’；其中探针序列的5’端采用FAM修饰，3’端采用MGB基团修饰。根据该发明的TaqMan引物能够快速鉴别FAdv‑4和FAdv‑8，可对FAdv阳性样品的绝对定量和样品中FAdv载量的计算。本发明提供的引物和探针序列具有良好的检测特异性和灵敏度。

技术领域

本发明属于禽疫病快速检测技术领域，具体地涉及一种快速鉴别和检 测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR方法。

背景技术

FAdv-4感染后导致禽类发生心包积液-肝炎综合征，近年来FAdv-4的 流行和爆发对禽类安全生产造成了巨大的损失。随着FAdv-4灭活疫苗的推 广使用，安卡拉病的发生逐渐得到有效控制。尽管如此，由FAdv-I引起的 禽类感染仍不可忽视，尤其是FAdv-8的流行。然而FAdv-8的流行、检测 方法和控制手段受限，可能对禽类生产造成不小的威胁。虽然已有禽腺病 毒荧光定量PCR快速检测试剂盒的技术，然而该技术仅限于检测FAdv-4。 基于此，本发明通过TaqMan实时荧光定量PCR技术对禽类组织中是否感 染FAdv-4或FAdv-8进行快速检测，为禽类的安全生产提供有力的保障。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，本发明提供了一种 快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR方法。

本发明采用的技术方案为：一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和 8型的TaqMan引物和探针序列，包括以下目的基因的特异性引物和探针， 其序列如下：

上游引物序列为：5’-TTCGACACGTCCATCAACTG-3’；

下游引物序列为：5’-GTCGTAGTGGAAGTACTGACG-3’；

探针序列：5’-TGCGACATCACCAAGGACT-3’；

其中探针序列的5’端采用FAM修饰，3’端采用MGB基团修饰。

进一步地，所述引物和探针序列导入Primer Premier 6.0中进行评价， 引物和探针序列之间无交叉反应。

一种快速鉴别和检测禽腺病毒血清4型和8型的TaqMan荧光定量PCR 方法，包括FAdv-4和FAdv-8荧光定量PCR标准曲线的建立、FAdv-4和 FAdv-8阳性病料的检测；

其中FAdv-4和FAdv-8荧光定量PCR标准曲线的建立包括标准曲线模 板DNA的配制、荧光定量PCR反应及标准曲线的绘制。

进一步地，所述标准曲线模板DNA的配制步骤如下：在PCR小管中 分别加入3μL重组质粒提取液和10μL TB(稀释液)，充分混匀，即稀释 为提取液的1/10，依次按照10倍梯度稀释，获得溶液的浓度依次为提取液 的10^-1、10^-2、…10^-9；

所述荧光定量PCR反应剂标准曲线的绘制步骤如下：以上述步骤中的 稀释后的溶液为阳性DNA模板来配制成荧光定量PCR反应体系；待反应 结束后，调整矫正线后记录每个浓度对应的平均Ct值，即荧光信号到达设 定阈值所需的循环数，绘制标准曲线；以Ct值为y轴，模板DNA中拷贝 数的对数为x轴，拟合的标准曲线为y＝-3.477x+40.169，R²＝0.9991；根据标准曲线的斜率可以计算出引物的扩增效率为94％。

进一步地，所述荧光定量PCR反应体系成分与用量如下：