[发明专利]一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物及应用

说明书

本发明公开了一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物及应用，属于DNA合成技术领域。通过使用体外选择技术(SELEX)，从一个随机序列的DNA库中，定向进化出针对T4DNA连接酶的最适DNA分子，能够采用结构安排，有利于分子内环化。本发明成功进化出一条最适底物，允许以极高的收率和选择性，在顺式和反式反应中大规模合成DNA环。此外，反式作用的模板有助于构建连锁DNA双环，可作为滚环扩增的自由模板。与传统的检测方法相比，本发明解决了传统成环过程中因没有明显熵差异不可避免得生成线性连接产物等问题，实现了环状核酸得高产率和高特异性制备。

技术领域

本发明属于DNA合成领域，具体涉及一种可利用DNA连接酶促进分子内环化的最适DNA底物以及两种反式连接模板及应用。

背景技术

环状核酸(CNAs)是指自然产生或人工产生的具有闭环结构的核酸分子。由于其在流动性、稳定性、拓扑结构和功能等方面的独特特点，在分子克隆、疾病治疗、医学诊断、生物传感、生物化学等领域得到了广泛的应用。CNAs也可被一些聚合酶以滚环方式进行复制，推动了滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)和滚环转录(rolling circletranscription,RCT)作为核酸扩增工具的普及。此外，CNAs可以很容易地与功能性核酸(如适配体、DNA酶、核酶和适体核酶)偶联，产生用于生物分析和生物医学应用的功能体系。

合成环状单链(ss)DNA的常用方法是使用连接酶，包括使用T4 DNA连接酶(T4DL)，在配对DNA短链的帮助下，密封ssDNA中3’-羟基和5’-磷酸端之间的缺口。另一种方法是利用其他连接酶(比如，CircLigase)催化具有末端互补性的ssDNA的末端连接。然而，由于不可避免地同时产生线性连接产物(LLP；两个或多个线性DNA分子的连接)。这是因为分子内环化和分子间连接这两种连接反应之间没有显著的熵差异。优化反应条件(如Mg(II)浓度、温度)和DNA序列设计(如茎长)可以在一定程度上提高产量和选择性，但不能从根本上排除分子间连接，通常需要更长的反应时间(长达数小时)。此外，在连接端附近的碱基对必须仔细设计，以减少尺寸、二级结构和拓扑结构对环化的负面影响。然而，基于CNAs的器件要在纳米尺度上显示复杂、可控和复杂的功能，并真正实现其潜力，需要提供高环化产率和选择性的新方法。

发明内容

本发明为了解决现有的技术问题，利用体外筛选技术获得可特异性作用于T4 DNA连接酶的最适DNA底物，其采用更有利于分子内环化而非分子间连接的结构制备单环DNA，提供一种高产率和高选择性生成CNAs的方法，扩大CNAs在化学生物学、诊断、计算和生物传感领域的实际应用。

本发明为解决上述技术问题，提供了一种与T4 DNA连接酶具有高亲和力的最适DNA底物，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一个反式连接DNA模板，可进行单链DNA文库的环化，包括如SEQID NO.25所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一个反式连接DNA模板，可进行互锁DNA双环D2C(DNA[2]catenanes)的制备，包括如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列。

进一步地，上述技术方案中，所述DNA底物的二级结构包含包含一个单链区域(SS1)、三个短双链(P1、P2和P3)、一个关键发夹环(L1)和一个双链间未配对元件(J2/3)，该结构可以进行高效分子内自环化。

进一步地，上述技术方案中，所述随机DNA文库为任一核苷酸序列，包括SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列。

进一步地，上述技术方案中，所述连接模板将上述筛选得到的DNA底物的P1和P2劈开，以及将两端结合臂的双链分别延长一定核苷酸，优选地，延长至12个核苷酸长度，可极大提高单环的产率。

优选地，将两端结合臂的双链分别延长的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.29和SEQID NO.30所示。