[发明专利]大豆PCL同源基因编辑位点及其应用在审

申请号：	202111139430.8	申请日：	2021-09-26
公开（公告）号：	CN113862282A	公开（公告）日：	2021-12-31
发明（设计）人：	孔令平;孔凡江;苏彤;张婷;方然	申请（专利权）人：	广州大学
主分类号：	C12N15/29	分类号：	C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00;A01H6/54
代理公司：	广州三环专利商标代理有限公司 44202	代理人：	陈旭红;晏静文
地址：	510006 广东省广***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	大豆 pcl 同源基因编辑及其应用
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【权利要求书】：

1.一种大豆PCL同源基因编辑位点，其特征在于，所述编辑位点为两段23个脱氧核糖核苷酸序列：5’-AGGTGCGTAAGAAGGGCCAAGGG-3’和5’-GGGGAATGATGTTGATGGGGAGG-3’。

2.含有权利要求1所述大豆PCL同源基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。

3.根据权利要求2所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9；所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。

4.根据权利要求3所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆PCL同源基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，所得sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过BsaI酶切后连接得到；

所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29中的两种。

5.权利要求1所述大豆PCL同源基因编辑位点、权利要求2-4任一项所述重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌在调节大豆生长发育状态和产量中的应用。

6.一种构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)按照如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示大豆PCL同源基因编辑位点的序列合成sgRNA；

(2)在sgRNA的5’端添加碱基GTCA，获得如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，将其反向互补得到sgRNA的反向序列，在其5’端添加碱基AAAC，获得如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列；分别将SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5与SEQ IDNO.6退火，形成双链DNA；

(3)构建sgRNA表达盒：将步骤(2)形成的双链DNA分别连接至两个sgRNA载体前，得到两个sgRNA表达盒；

(4)将步骤(3)中所述sgRNA表达盒串联，并与表达载体连接，得到Cas9sgRNA重组表达载体；

(5)将步骤(4)中所述Cas9 sgRNA重组表达载体转化至发根农杆菌，并侵染大豆子叶；

(6)除草剂筛选，得到转基因植株。

7.根据权利要求6所述构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法，其特征在于，步骤(4)中，当NGG第20位碱基为A时，sgRNA的5’端添加碱基为GTC。

8.根据权利要求6所述构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法的方法，其特征在于，

步骤(3)中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29中的两种；

步骤(4)中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9。

9.根据权利要求6所述构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤(4)中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切。

10.根据权利要求6所述构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法，其特征在于，

步骤(5)中所述发根农杆菌为K599；

步骤(6)中所述筛选转基因系采用的除草剂为Basta。