[发明专利]大豆PCL同源基因编辑位点及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，发明公开了一种大豆PCL同源基因编辑位点及其应用。本发明的大豆PCL同源基因编辑位点为两段各23个脱氧核糖核苷酸序列：5’‑AGGTGCGTAAGAAGGGCCAAGGG‑3’和5’‑GGGGAATGATGTTGATG GGGAGG‑3’。这两个编辑位点是对四个PCL同源基因第一个外显子进行编辑的有效靶标，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得四个PCL同源基因不同的等位基因突变体；为理解PCL四个同源基因对大豆生长发育和产量的调控提供了材料，也为培育大豆新品种提供了可靠的手段和素材。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆PCL同源基因编辑位点及其应用。

背景技术

为了保护自身免受外源遗传物质(如噬菌体、质粒)的侵袭，细菌和古细菌进化出了一种RNA分子介导的获得性免疫系统，称为CRISPR(Mojica,et al.)。2013年，研究者利用化脓性链球菌的Cas9蛋白首次在哺乳动物细胞中实现了RNA引导下的精确靶向和基因组序列修饰，为CRISPR/Cas9作为一种广泛应用的基因组编辑工具奠定了基础。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。刘耀光教授及其团队研发了高效简便的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统(Ma et al.,2016)，在该系统中，可以通过设计不同目标序列的多个导向RNA(sgRNA)，将Cas9蛋白靶向到多个基因组位点上，同时进行多基因编辑，也可以在目的基因的启动子或UTR区域设计靶点，对目的基因的启动子或UTR进行编辑，调节目的基因的表达量。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。例如，Hendelman等通过对SlWOX9基因的启动子进行编辑产生不同的等位基因，发现SlWOX9在营养和生殖发育中的多效性作用；通过CRISPR/Cas9技术同时敲除了大豆AP1基因的四个同源基因(AP1a、AP1b、AP1c和AP1d)，获得了纯合的ap1a ap1b ap1c ap1d四突变体。ap1突变后主茎节数增加(Chen etal.,2020)；这对基因组编辑在农业中的应用具有重要意义(Hendelman et al.,2021)。

PHD(Plant Homedomain)结构是真核生物中进化保守的锌指结构域，在基因转录和染色质状态调控方面起重要作用。植物PHD转录因子家族参与生长及发育的调控，同时在植物非生物胁迫途径中发挥作用。Thomas等人发现拟南芥中的VIN3和VRN5在春化作用中发挥功能(Thomas et al.,2007)；PRHA基因能够参与调控抗病相关基因的表达(Yoshimochiet al.,2009)。在水稻中过量表达OsPHD1基因，能够增强抗逆性能，使转基因植株对低温、高盐和干旱胁迫的耐受性分别提高43.3％、60％和25％(刘雨，等2011)；MS1是参与花粉成熟的核信号分子(Korfhage et al.,1994)；HAZ1能够标识球形胚径向轴分化(Yukihiro etal.,2004)。杨雷等分析棉花在干旱、高盐(150mmol/L NaCl)、低温(4℃)非生物胁迫下PHD转录因子的表达，结果表明，部分PHD转录因子在陆地棉应答和适应非生物胁迫过程中可能发挥重要作用。

目前，对大豆中PHD转录因子的功能研究较少。本发明中四个大豆PCL(polycomb-like)同源蛋白均含有PHD结构，通过CRISPR/Cas9技术同时敲除四个大豆PCL同源基因，将为PCL基因的功能研究提供遗传材料，为提高大豆适应性和产量奠定理论基础。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大豆PCL同源基因编辑位点。

本发明的另一目的在于提供上述大豆PCL同源基因编辑位点的应用。

本发明的再一目的在于提供一种构建PCL同源基因突变体遗传材料的方法。