[发明专利]一种单细胞全长转录本建库测序方法

权利要求书

1.一种单细胞全长转录本建库测序方法，包括如下步骤：

A)对单细胞的mRNA进行双标记和C转化，得到双标记cDNA；

所述双标记包括单细胞标记和U组合标记；

所述单细胞标记为用带有单细胞标记序列的PolyT的oligo引物捕获所述mRNA；

所述U组合标记为将所述mRNA在模板转换TSO引物和逆转录酶作用下进行逆转录和模板转换反应，且反应时加入甲基化C或羟甲基化C进行实现再次标记，形成带有甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA；

所述C转化为将带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C或非甲基化C转化为U，得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA或不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA，记作双标记cDNA；

B)将所述双标记cDNA进行预扩增、打断、文库构建，得到单细胞全长转录本文库；

C)测序所述单细胞全长转录本文库，实现单细胞全长转录本建库测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤A按照如下方法实现：

1)裂解单细胞mRNA，再采用所述PolyT的oligo引物捕获所述mRNA，得到带有PolyT的oligo引物结合的mRNA；

2)将带有单细胞标记的mRNA在所述模板转换TSO引物和逆转录酶作用下进行逆转录和模板转换反应，且反应时加入甲基化C或羟甲基化C实现再次标记，得到带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA；

3)将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C转化为U，得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA，记作双标记cDNA；

或将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的非甲基化C转化为U，得到不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA，记作双标记cDNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤A照如下方法实现：

1)裂解单细胞的mRNA作为模板，在所述PolyT的oligo引物、所述模板转换TSO引物的作用下进行逆转录和模板转换反应，且在所述逆转录和模板转换反应中加入甲基化C或羟甲基化C，得到带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA；

2)将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C转化为U，得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA，记作双标记cDNA；

或将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的非甲基化C转化为U，得到不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA，记作双标记cDNA。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述PolyT的oligo引物包括通用引物序列、接头序列、细胞标记序列、UMI、PolyT和NV核苷酸；

所述NV核苷酸中的N为A/T/C/G四种碱基任意一种，V为A/C/G三种碱基任意一种；

所述模板转换TSO引物包括所述通用引物序列和连续的三个rG。

5.一种单细胞全长转录本建库方法，包括权利要求1-4中任一项中的步骤A)-B)。

6.一种单细胞全长转录本建库测序的试剂盒，包括权利要求2-4中任一项中的如下物质：

1)所述PolyT的oligo引物；

2)所述模板转换TSO引物；

3)用于甲基化C转化为U的试剂或用于非甲基化C转化为U的试剂。

7.权利要求1-5任一项所述的方法在进行单细胞全长转录本建库测序中的应用；

或权利要求1-5任一项所述的方法在空间转录全长转录本建库测序中的应用。

8.权利要求6所述的试剂盒在进行单细胞全长转录本建库测序中的应用；

或，权利要求6所述的试剂盒在空间转录全长转录本建库测序中的应用。