[发明专利]一种单细胞全长转录本建库测序方法

说明书

本发明公开了单细胞全长转录本建库测序方法。本发明提供了一种单细胞全长转录本建库测序方法，包括如下步骤：A)对单细胞的mRNA进行单细胞标记和U组合标记；B)将所述双标记cDNA进行预扩增、打断、文库构建，得到单细胞全长转录本文库；C)测序所述单细胞全长转录本文库，实现单细胞全长转录本建库测序。本发明使用胞嘧啶与甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶可以在重亚硫酸盐或脱氨酶的作用发生转化而发生碱基改变(变成T)基础上，使用甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶在逆转录时加入到cDNA上的位置组合来对原始的RNA分子进行标记，利用标记来确定测序序列是否来自同一RNA分子，从而组装成全长转录本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种单细胞全长转录本建库测序方法。

背景技术

单细胞转录组测序是对单个细胞的转录组进行测序，是目前高通量测序技术中被用的最广泛的技术之一，可以对组织或细胞在特定时间或功能状态下转录的RNA进行高通量测序。单细胞转录组测序让对细胞的异质性、细胞发育、肿瘤微环境等研究从混合细胞到了单细胞的水平，可以进一步揭示了生物体的细胞水平的变化规律，为精准医疗带来巨大的进步。单细胞转录组技术可以将细胞分为不同的类型，同时可以将同种类型的细胞区分为不同亚型。而且已经可以利用微孔芯片或油包水液滴等技术或产品，实现一次对成千上万的单细胞进行转录组建库测序，例如10xgenomics的单细胞RNA测序产品或者BD公司的相应产品。高通量单细胞转录组测序技术的出现，使得研究人员可以对更多不同物种的不同组织的细胞进行大规模的转录组分析，构建细胞图谱，研究细胞类群与细胞个体的差异，更好的理解不同组织细胞的功能与变化。但是目前常用的高通量单细胞转录组测序方案都只能获得mRNA 3’端的信息，只能对基因的表达量进行分析，而无法获得全长转录本的信息，丢失了大量信息，造成无法对基因的可变剪切以及其Isoform进行深入研究。高通量单细胞全长转录组测序技术可以同时对大量单细胞进行全长转录组测序，获得每个细胞中mRNA的完整信息，除基因表达量以外，还可以分析同一个基因在不同细胞中的表达形式，对以往由不同基因的表达量的差异而区分出来的细胞类群进行进一步的分析。拥有转录本的完整RNA序列可以揭示RNA是如何被处理的(例如，通过编码部分的选择性剪接)，以及RNA是由母亲还是父亲的基因复制(等位基因)产生的。

解决上述问题的方案目前有如下两种：

一、成熟的高通量单细胞RNA建库技术结合单分子测序：

比如利用10X Genomics公司的单细胞RNA建库试剂盒得到单个细胞的全长cDNA文库，然后用Pacbio平台或ONT平台的建库技术进行建库，然后利用单分子测得单个细胞全长转录本，通过研究不同亚群细胞的转录本特征，发现了亚群特异的转录本，这从另外一个视野研究了细胞的异质性。单细胞RNA建库结合单分子测序具体方案：使用现有smart-seq或smart-seq2的方法得到单细胞中全长的cDNA，即采用带有oligo-dT的逆转录引物与单细胞中的mRNA上的polyA进行杂交，使用的MMLV逆转录酶可以在完成全长RNA逆转录后，在cDNA的5’末端加上3个C碱基，然后使用TSO(Template switch oligo)引物进行模板转换，TSO引物3’由3个鸟嘌呤核糖核苷酸(rGrGrG)和5’的同用引物组成，完成逆转录后，使用通用引物可以扩增得到全长的双链cDNA，再根据使用的单分子测序平台对应的建库技术，进行建库(比如Pacbio和ONT)，之后对全长的cDNA文库进行测序，从而得到单细胞的全长转录本。