[发明专利]一种大肠杆菌及其在高产制备D-脯氨酸中的应用

说明书

本申请从水环境中微生物种群筛选分离出能够代谢葡萄糖合成D‑脯氨酸的大肠杆菌并进行持续迭代选育而获得了一株可产少量D‑脯氨酸的大肠杆菌TIMDP，并进一步通过D‑脯氨酸合成能力增强的基因改造而工程菌株大肠杆菌TIMDP1。该菌株已于2021年8月13日保藏于中国典型微生物保藏中心，保管编号为CCTCC NO：M 20211024。经过实验验证，改造后的大肠杆菌TIMDP1脯氨酸合成能力得到大大增强，具有较大的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株能够生产D-脯氨酸的大肠杆菌，以及利用该菌种发酵生产D-脯氨酸的方法及应用。

背景技术

D-脯氨酸是一种重要的非天然氨基酸，其结构式如下所示：

D-脯氨酸是多种生物活性化合物的前体，可以被用于合成血清淀粉样P成分消耗剂、抗肿瘤创新药吡咯替尼、偏头痛药物依来曲普坦等药物，还可以作为抗菌肽的基本结构单元。除此之外，由于其拥有良好的构象刚性，也经常作为非对称合成的有机催化剂来使用。例如可以使用D型脯氨酸来催化交叉羟醛缩合反应以得到不同构象的产物。

现行的D-脯氨酸合成主要是通过化学法来实现，通过合成外消旋脯氨酸、酒石酸拆分等多步工艺进行制备，在工业生产上，化学法步骤繁琐，污染环境。因此，开发更为环保的D-脯氨酸不对称合成方法具有重要的应用价值。

生物工作者对手性D-脯氨酸合成的合成也做了一些尝试。以外消旋脯氨酸作为底物，使用具有手性选择性的假丝酵母（JP 95-289275）或解木糖赖氨酸芽孢杆菌（CN111424060A）将L-脯氨酸消除，从而获得剩余的D-脯氨酸。然而此类动力学拆分的方法，D-脯氨酸的理论收率最高仅为50%，造成大量浪费。

因此，需要进一步开发高效制备D-脯氨酸的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种高产D-脯氨酸的大肠杆菌及其发酵生产D-脯氨酸的应用方法。

本发明首先提供大肠杆菌菌株（Escherichia coli）TIMDP1，该菌株已于2021年8月13日保藏于中国典型微生物保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学内)，保管编号为CCTCC NO：M 20211024。

本发明的大肠杆菌可用于生产D-脯氨酸，因而本发明提供所述大肠杆菌在生产D-脯氨酸中的应用。

本发明进一步提供一种使用所述的大肠杆菌TIMDP1制备D-脯氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：通过发酵培养所述大肠杆菌TIMDP1，并从发酵液中获得D-脯氨酸。

其中发酵培养基中以葡萄糖为碳源、以硫酸铵为氮源，更优选地，在发酵培养基中的葡萄糖添加量为2%-6%（w/v）；所述的硫酸铵的添加量为1%-3%。